生理活性タンパク質や生物学的応用の光化学ハイドロゲルのペプチドをパターニング
Summary
この方法は、光重合を用いてクリック化学の手法を提供するポリエチレング リコール (PEG) ゲルの表面にタンパク質やペプチドのパターンを作成する生体外での細胞の研究のため生体信号を固定化、.
Abstract
細胞の挙動と細胞分化に影響を与えることができる多くの生物学的刺激があります。一般的な細胞培養方法は、セルの動作を制御する媒体内の可溶性因子に依存します。ただし、特定のマトリックス バインド成長因子などのモチーフをシグナル伝達、細胞間シグナリング、や細胞への一般的な影響は、空間的生化学的な手がかり可溶性追加を模倣することはできません。さらに、基板剛性など、行列の生物物理プロパティは細胞の運命は、簡単操作ではない従来セル培養のプラクティスを使用しての重要な役割を果たします。このメソッドは、光化学を使用して合成ポリエチレング リコール (PEG) ゲル上パターンの生理活性タンパク質を提供する簡単なプロトコルについて述べる。このプラットフォームにより基板の剛性と空間的生化学的な手がかりの独立制御。これらのゲルは、広い範囲の生理学的関連性の高い剛性値を実現できます。さらに、これらのゲルの表面は生理活性ペプチドで photopatterned をすることができます。 またはチオール-エンでタンパク質は、化学反応をクリックします。これらのメソッドは、表面固定化後のタンパク質の機能を保持するために最適化されています。さまざまなパターンを作成する興味のペプチッドか蛋白質に適用できる汎用性の高いプロトコルです。最後に、空間的特定の信号に対応する、これらの生理活性ハイドロゲルの表面に播種された細胞を時間の経過と共に監視できます。
Introduction
セルの動作に影響を与える多くの刺激があります。一般的に、典型的な細胞培養技術は、細胞の反応を引き出すために水溶性の要因に頼るただし、この方法には制限があります。これらのメソッドは一般的に見られるすべてのシグナリング モチーフを正確に表示することができる体内。そのようなシグナル伝達のメカニズムには、人里離れた成長因子、細胞間シグナリング、固有空間的生化学的手がかりが含まれます。また、基板剛性細胞の挙動と細胞分化の重要な役割を再生することができます、簡単に一般的な細胞培養プラクティス1,2を使用して操作できません。生体材料のアプローチは、これらのシグナル伝達メカニズムを探索を開始する新しいプラットフォームを提供します。特に、ゲル基板剛性3,4、固定化タンパク質とペプチド5,6のチューニングと空間的特定のパターン7,を作成するため優秀な候補者であります。8。
ヒドロゲルは細胞外マトリックス (ECM)9,10の生物物理学的・生化学的共通性による組織工学の足場として一般的に使用されます。自然ポリマーは、生体適合性、ボディの多くのティッシュで見つけたに足場のため、一般的な選択肢です。天然高分子の基質として使用制限は、化反応の化学簡単操作の部分を欠いていることです。その一方で、合成ハイドロゲルようペグ、ターゲットを絞った化学11,12の優れたプラットフォーム。また、PEG ヒドロゲルは細胞応答を引き出すない、したがって不活性のバックボーンとして生理活性の足場を作成に使用されます。
生理活性のゲルを作成するには、光重合とチオール-エン化学反応の方をクリックします。これらの光反応、重合と UV 光源が必要です。光重合開始剤は、紫外線に導入されるとき、フォーム ラジカルへの債券を解除します。論文ラジカル反応を開始するために必要なタンパク質活性12,13に悪影響を与えることができます。したがって、重合とタンパク質の生理活性を維持するために UV 露光時間を最適化することが重要です。
このメソッドのヒドロゲルはアクリル酸アクリル酸鎖成長重合によって合成されます。ペグ レート (PEGDA) のモノマーは、お互いヒドロゲルの構造に責任がある分岐高分子ネットワークを形成する反応します。ゲル前駆体溶液の PEGDA 単量体の濃度は、基板の剛性を制御します。毛穴のヒドロゲルのサイズを小型のため、フィブロネクチンなどの ECM 蛋白質は細胞接着を目的としてハイドロゲル内簡単に組み込むことができます。最後に、これらのゲルは生理活性ペプチドで表面パターニングすることができます。 またはチオール-エンでタンパク質は、化学反応をクリックします。ここでは、ハイドロゲル システム内で無料官能アクリレート未反応蛋白質またはペプチッド紫外線にさらされたときに位置する無料のチオールと反応します。タンパク質やペプチドはハイドロゲル表面に固定化後、ヒドロゲル格納できます 4 ° C で数週間の生理活性を失うことがなく。これは、利便性、柔軟な実験計画および研究所間の連携の可能性を提供しています。全体的にみて、このプラットフォームにより生体力学的・空間的生化学的制御、細胞挙動に影響を与える機会を互いの独立しました。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルは、生物学的応用のための生理活性タンパク質パターンを作成するためのメソッドを提供します。さまざまな実験のこのプロトコルを適応させることができますいくつかの変更があります。最初に、異なる種類の細胞の細胞添付要件は異なります。ゲルに悪い細胞接着が最初に観測される場合は ECM タンパク質前駆体溶液中の濃度が増加することをお勧めします。その他の ECM …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この調査は、アメリカ心臓協会の科学者開発補助金からの助成金によってサポートされた主に (g. d. に 12SDG12050083)、国立衛生研究所 (R21HL102773、g. d. に R01HL118245)、全米科学財団 (あわせて 1263455 とG. d. に CBET-1350240)。
Materials
| PEG-diacrylate (PEGDA) | Laysan Bio | ACRL-PEG-ACRL-3400 | Can also be synthesized or purchased through other venders. Different molecular weights can be used. |
| Lithium Phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP) | Synthesized in lab | ||
| Fibronectin | Corning | 356008 | Other cell attachment proteins can be used, such as laminin, matrigel |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma | D8537-500ML | |
| Photomask | FineLine Imaging | n/a | Custom prints on transparent sheets with high resolution DPI. |
| Binder Clips | Various Vendors | ||
| Compact UV Light Source (365nm) | UVP | UVP-21 | Other UV light sources can be used, calibration of power is required. |
| 2-iminothiolane (Pierce Traut’s Reagent) | Thermo Sci. | 26101 | |
| Ellman’s Reagent: DTNB; 5,5-dithio-bis(2-nitrobenzoic acid) | Thermo Sci. | 22582 | |
| human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) | Lonza | passage number between 6- 10 | |
| EGM-2 Media | Lonza | CC31-56, CC-3162 | EGM-2 without growth factors was used in experiments. Full EGM-2 media was used for cell maintainance |
| 0.25% Trypsin EDTA | Life Tech | 25200-056 | |
| Trypsin Neutralizer | Life Tech | R-002-100 | |
| Centrifuge | Various Venders | ||
| Hemocytometer | Hausser Sci. Bright-line | ||
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma Aldrich | E6758 | |
| 0.22µm filter | Cell Treat | 229743 | |
| 1mL Syringe | |||
| Glass Microscope Slides | Fisher Sci. | 12-550C | |
| Plastic spacers | Various Venders | 0.5mm thickness | |
| 70% Ethanol | BICCA | 2546.70-1 | |
| Bio-shield | Bio-shield | 19-150-0010 | |
| Bradford Reagent | BIO-RAD | ||
| Desalting Resin – Sephadex G-25 | GE Healthcare | 95016-754 | |
| Microspin Columns | Thermo Sci. | PI69725 | |
| AR-G2 rehometer | TA Instruments |
References
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