Summary

Isolatie van type I en type II pericytes uit muizenskeletspieren

Published: May 26, 2017
doi:

Summary

Dit werk beschrijft een FACS-based protocol dat het mogelijk maakt om de gelijktijdige isolatie van type I en type II pericytes uit skeletspieren mogelijk te maken.

Abstract

Pericytes zijn perivasculaire multipotente cellen die heterogeniteit in verschillende organen of zelfs in hetzelfde weefsel laten zien. In skeletspieren zijn er minstens twee pericyte subpopulaties (genaamd type I en type II), die verschillende moleculaire markers uitdrukken en onderscheidende mogelijkheden hebben. Met behulp van NG2-DsRed en Nestin-GFP dubbel transgene muizen zijn type I (NG2-DsRed + Nestin-GFP ) en type II (NG2-DsRed + Nestin-GFP + ) pericytes succesvol geïsoleerd. De beschikbaarheid van deze dubbel-transgene muizen voorkomt echter het wijdverspreide gebruik van deze zuiveringsmethode. Dit werk beschrijft een alternatief protocol dat de eenvoudige en gelijktijdige isolatie van type I en type II pericytes van skeletspieren mogelijk maakt. Dit protocol maakt gebruik van de fluorescentie geactiveerde celsortering (FACS) techniek en richt zich op PDGFRβ, in plaats van NG2, samen met het Nestin-GFP signaal. Na isolatie, typ I en tyPe II pericytes tonen verschillende morfologieën. Daarnaast zijn type I en type II pericytes geïsoleerd met deze nieuwe werkwijze, zoals die welke zijn geïsoleerd van de dubbel-transgene muizen, respectievelijk adipogene en myogene. Deze resultaten suggereren dat dit protocol kan worden gebruikt om pericyte subpopulaties van skeletspieren en mogelijk uit andere weefsels te isoleren.

Introduction

Spierdystrofie is een spier-degeneratieve aandoening die tot nu toe geen effectieve behandelingen heeft. De ontwikkeling van therapieën die weefselregeneratie bevorderen is altijd van groot belang geweest. Weefselregeneratie en reparatie na schade is afhankelijk van ingezeten stamcellen / stamcellen 1 . Satellietcellen zijn toegewijd aan myogene precursorcellen die bijdragen aan spierregeneratie 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 . Hun klinische gebruik wordt echter belemmerd door hun beperkte migratie en een laag overlevingspercentage na injectie, evenals door hun verminderde differentiatiecapaciteit na in vitro amplificatie 8 , 9 , 10 , 11 . Naast satelliTe cellen, skeletspieren bevatten ook veel andere celpopulaties met myogenisch potentieel 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , zoals bloedplaatjes afgeleide groeifactor receptor-beta (PDGFRβ) -positieve interstitiële cellen. Er zijn aanwijzingen dat spierafgevaardigde PDGFRβ + cellen in myogene cellen kunnen differentiëren en de spierpatologie en functie 14 , 17 , 18 , 19 , 20 verbeteren. PDGFRβ overwegend labels pericytes 21 , die perivasculaire cellen zijn met pluripotentie 22 , 23 . Naast PDGFRβ worden veel andere markers, waaronder Neuron-Glial 2 (NG2) en CD146, ook gebruikt omDentify pericytes 21 . Er dient echter op te worden gewezen dat geen van deze markers percytespecifieke 21 is . Uit recente studies bleken twee subtypen van spierpericieten, genaamd type I en type II, die verschillende moleculaire markers uitdrukken en verschillende functies 19 , 24 , 25 uitvoeren. Biochemisch zijn type I pericytes NG2 + Nestin terwijl type II pericytes NG2 + Nestin + 19 , 24 zijn . Functioneel kunnen type I pericytes adipogene differentiatie ondergaan, die bijdragen aan vetaccumulatie en / of fibrose, terwijl type II pericytes langs de myogene route kunnen differentiëren, die bijdragen tot spierregeneratie 19 , 24 , 25 . Deze resultaten tonen aan dat: (1) type I pericytes mag bE gericht op de behandeling van vetdegeneratieve stoornissen / fibrose, en (2) type II pericyten hebben een groot therapeutisch potentieel voor spierdystrofie. Verdere onderzoek en karakterisering van deze populaties vereisen een isolatieprotocol dat de afscheiding van type I en type II pericytes op een hoog niveau van zuiverheid mogelijk maakt.

Momenteel is de isolatie van pericyte subpopulaties afhankelijk van NG2-DsRed en Nestin-GFP dubbel-transgene muizen 19 , 24 . De beschikbaarheid van NG2-DsRed-muizen en de kwaliteit van de meeste NG2-antilichamen beperken het wijdverspreide gebruik van deze methode. Aangezien alle NG2 + pericytes ook PDGFRβ uitdrukken in de skeletspieren 19 , 20 , 24 , veronderstellen wij dat NG2 kan vervangen worden door PDGFRβ voor de isolatie van pericyten en hun subpopulaties. Dit werk beschrijft een FACS-based protocol datGebruikt PDGFRβ-kleuring en het Nestin-GFP-signaal. Deze methode is minder veeleisend voor onderzoekers omdat: (1) het NG2-DsRed-achtergrond niet vereist en (2) het commercieel beschikbare PDGFRβ-antilichamen gebruikt, die goed gekarakteriseerd zijn. Bovendien zorgt het voor gelijktijdige isolatie van type I en type II pericytes met een hoge zuiverheid, waardoor het biologisch en therapeutisch potentieel van deze pericyte subpopulaties verder kan worden onderzocht. Na zuivering kunnen deze cellen in cultuur worden gekweekt, en hun morfologieën kunnen worden gevisualiseerd. Dit werk laat ook zien dat type I en type II pericytes die geïsoleerd zijn met behulp van deze methode, zoals die welke zijn gesuiverd uit dubbel-transgene muizen, respectievelijk adipogene en myogene zijn.

Protocol

Wildtype en Nestin-GFP transgene muizen werden gehuisvest in de dierenfaciliteit aan de Universiteit van Minnesota. Alle experimentele procedures werden goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee aan de Universiteit van Minnesota en waren in overeenstemming met de NIH Guide for Care and Use of Laboratory Animals. 1. Spierdissectie en enkelcellige isolatie Euthanize volwassen muizen (6-10 weken, zowel mannelijk als vrouwelijk) met tribromoethanol (250 mg / kg,…

Representative Results

FACS-parameters, inclusief laserintensiteit en kanaalcompensatie, worden gecorrigeerd op basis van de resultaten van onbeschadigde besturing en enkele kleurenbesturing. De PDGFRβ-PE-FMO controle wordt gebruikt om de poort voor de PDGFRβ-PE + populatie te bepalen ( Figuur 1A ). Onder de PDGFRβ-PE – cellen zijn twee populaties die Nestin-GFP + en Nestin-GFP – cellen vertegenwoordigen duidelijk gescheiden ( <strong…

Discussion

Pericytes zijn multipotente perivasculaire cellen 22 , 23 gelegen op het abluminale oppervlak van capillairen 21 , 26 . In skeletspieren kunnen pericytes langs de adipogene en / of myogene pathussen 19 , 20 , 24 differentiëren. Recente studies onthulde twee subpopulaties van pericytes, met verschillende markeri…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door een Fonds-A-Fellow subsidie ​​van de Myotonic Dystrophy Foundation (MDF-FF-2014-0013) en de Scientific Development Grant van de American Heart Association (16SDG29320001).

Materials

Cell Sorter Sony SH800
Automatic Setup Beads Sony LE-B3001
DMEM Gibco 11995
Avertin  Sigma T48402
Pericyte Growth Medium ScienCell 1201
MSC Basal Medium (Mouse) Stemcell Technologies 5501
Adipogenic Stimulatory Supplement (Mouse) Stemcell Technologies 5503
Fetal Bovine Serum Gibco 16000
Horse Serum Sigma H1270
Collagenase Type 2 Worthington LS004176
0.25% Trypsin/EDTA  Gibco 25200
Penicillin/Streptomycin Gibco 15140
PDL Sigma P6407
PDGFRβ-PE Antibody eBioscience 12-1402
Perilipin Antibody Sigma P1998
S-Myosin Antibody DSHB MF-20
Alexa 555-anti-rabbit antibody  ThermoFisher Scientific A-31572
Alexa 555-anti-mouse antibody ThermoFisher Scientific A-31570
Mounting Medium with DAPI Vector Laboratories H-1200
DAPI ThermoFisher Scientific D1306
HEPES Gibco 15630
EDTA Fisher BP120
BSA Sigma A2058
NH4Cl Fisher Scientific A661
KHCO3 Fisher Scientific P184
PBS Gibco 14190
18G Needles BD 305196
10ml Serological Pipette BD 357551

References

  1. Rennert, R. C., Sorkin, M., Garg, R. K., Gurtner, G. C. Stem cell recruitment after injury: lessons for regenerative medicine. Regenerative medicine. 7 (6), 833-850 (2012).
  2. Sambasivan, R., et al. Pax7-expressing satellite cells are indispensable for adult skeletal muscle regeneration. Development. 138 (17), 3647-3656 (2011).
  3. Relaix, F., Zammit, P. S. Satellite cells are essential for skeletal muscle regeneration: the cell on the edge returns centre stage. Development. 139 (16), 2845-2856 (2012).
  4. von Maltzahn, J., Jones, A. E., Parks, R. J., Rudnicki, M. A. Pax7 is critical for the normal function of satellite cells in adult skeletal muscle. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (41), 16474-16479 (2013).
  5. Lepper, C., Partridge, T. A., Fan, C. M. An absolute requirement for Pax7-positive satellite cells in acute injury-induced skeletal muscle regeneration. Development. 138 (17), 3639-3646 (2011).
  6. Kuang, S., Charge, S. B., Seale, P., Huh, M., Rudnicki, M. A. Distinct roles for Pax7 and Pax3 in adult regenerative myogenesis. J Cell Biol. 172 (1), 103-113 (2006).
  7. Murphy, M. M., Lawson, J. A., Mathew, S. J., Hutcheson, D. A., Kardon, G. Satellite cells, connective tissue fibroblasts and their interactions are crucial for muscle regeneration. Development. 138 (17), 3625-3637 (2011).
  8. Morgan, J. E., Pagel, C. N., Sherratt, T., Partridge, T. A. Long-term persistence and migration of myogenic cells injected into pre-irradiated muscles of mdx mice. J Neurol Sci. 115 (2), 191-200 (1993).
  9. Beauchamp, J. R., Morgan, J. E., Pagel, C. N., Partridge, T. A. Dynamics of myoblast transplantation reveal a discrete minority of precursors with stem cell-like properties as the myogenic source. J Cell Biol. 144 (6), 1113-1122 (1999).
  10. Partridge, T. A. Invited review: myoblast transfer: a possible therapy for inherited myopathies. Muscle Nerve. 14 (3), 197-212 (1991).
  11. Montarras, D., et al. Direct isolation of satellite cells for skeletal muscle regeneration. Science. 309 (5743), 2064-2067 (2005).
  12. Asakura, A., Seale, P., Girgis-Gabardo, A., Rudnicki, M. A. Myogenic specification of side population cells in skeletal muscle. J Cell Biol. 159 (1), 123-134 (2002).
  13. Tamaki, T., et al. Skeletal muscle-derived CD34+/45- and CD34-/45- stem cells are situated hierarchically upstream of Pax7+ cells. Stem Cells Dev. 17 (4), 653-667 (2008).
  14. Dellavalle, A., et al. Pericytes resident in postnatal skeletal muscle differentiate into muscle fibres and generate satellite cells. Nat Commun. 2, 499 (2011).
  15. Mitchell, K. J., et al. Identification and characterization of a non-satellite cell muscle resident progenitor during postnatal development. Nat Cell Biol. 12 (3), 257-266 (2010).
  16. Pannerec, A., Formicola, L., Besson, V., Marazzi, G., Sassoon, D. A. Defining skeletal muscle resident progenitors and their cell fate potentials. Development. 140 (14), 2879-2891 (2013).
  17. Dellavalle, A., et al. Pericytes of human skeletal muscle are myogenic precursors distinct from satellite cells. Nat Cell Biol. 9 (3), 255-267 (2007).
  18. Kostallari, E., et al. Pericytes in the myovascular niche promote post-natal myofiber growth and satellite cell quiescence. Development. 142 (7), 1242-1253 (2015).
  19. Birbrair, A., et al. Role of pericytes in skeletal muscle regeneration and fat accumulation. Stem Cells Dev. 22 (16), 2298-2314 (2013).
  20. Yao, Y., Norris, E. H., Mason, C. E., Strickland, S. Laminin regulates PDGFRbeta(+) cell stemness and muscle development. Nat Commun. 7, 11415 (2016).
  21. Armulik, A., Genove, G., Betsholtz, C. Pericytes: developmental, physiological, and pathological perspectives, problems, and promises. Dev Cell. 21 (2), 193-215 (2011).
  22. Dore-Duffy, P. Pericytes: pluripotent cells of the blood brain barrier. Curr Pharm Des. 14 (16), 1581-1593 (2008).
  23. Dore-Duffy, P., Katychev, A., Wang, X., Van Buren, E. CNS microvascular pericytes exhibit multipotential stem cell activity. J Cereb Blood Flow Metab. 26 (5), 613-624 (2006).
  24. Birbrair, A., et al. Skeletal muscle pericyte subtypes differ in their differentiation potential. Stem Cell Res. 10 (1), 67-84 (2013).
  25. Gautam, J., Nirwane, A., Yao, Y. Laminin differentially regulates the stemness of type I and type II pericytes. Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 28 (2017).
  26. Birbrair, A., et al. Pericytes: multitasking cells in the regeneration of injured, diseased, and aged skeletal muscle. Front Aging Neurosci. 6, 245 (2014).

Play Video

Cite This Article
Nirwane, A., Gautam, J., Yao, Y. Isolation of Type I and Type II Pericytes from Mouse Skeletal Muscles. J. Vis. Exp. (123), e55904, doi:10.3791/55904 (2017).

View Video