Summary

Isolamento de Pericitos Tipo I e Tipo II de Músculos Esqueléticos de Rato

Published: May 26, 2017
doi:

Summary

Este trabalho descreve um protocolo baseado em FACS que permite o isolamento fácil e simultâneo de pericitos tipo I e tipo II dos músculos esqueléticos.

Abstract

Pericitos são células multipotentes perivasculares que mostram heterogeneidade em diferentes órgãos ou mesmo dentro do mesmo tecido. Nos músculos esqueléticos, há pelo menos duas subpopulações de pericitos (chamadas de tipo I e tipo II), que expressam diferentes marcadores moleculares e possuem distintas capacidades de diferenciação. Utilizando ratinhos duplamente transgénicos NG2-DsRed e Nestin-GFP, os pericitos de tipo I (NG2-DsRed + Nestin-GFP-) e de tipo II (NG2-DsRed + Nestin-GFP + ) foram isolados com sucesso. Contudo, a disponibilidade destes ratinhos duplamente transgénicos impede o uso generalizado deste método de purificação. Este trabalho descreve um protocolo alternativo que permite o isolamento fácil e simultâneo de pericitos tipo I e tipo II a partir de músculos esqueléticos. Este protocolo utiliza a técnica de triagem de células activada por fluorescência (FACS) e alvos PDGFRβ, em vez de NG2, juntamente com o sinal de Nestin-GFP. Após o isolamento, o tipo I e tyOs pericitos II apresentam morfologias distintas. Adicionalmente, os pericitos de tipo I e de tipo II isolados com este novo método, como os isolados a partir de ratinhos duplamente transgénicos, são adipogénicos e miogénicos, respectivamente. Esses resultados sugerem que este protocolo pode ser utilizado para isolar subpopulações de pericitos dos músculos esqueléticos e, possivelmente, de outros tecidos.

Introduction

A distrofia muscular é uma desordem músculo-degenerativa que não tem nenhum tratamento eficaz até agora. O desenvolvimento de terapias que promovem a regeneração de tecidos tem sido sempre de grande interesse. A regeneração e reparação dos tecidos após os danos dependem das células estaminais / células progenitoras residentes 1 . As células satélites são células precursoras miogénicas comprometidas que contribuem para a regeneração muscular 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 . O seu uso clínico, no entanto, é dificultado pela sua migração limitada e baixa taxa de sobrevivência após a injecção, bem como pela sua diminuição da capacidade de diferenciação após a amplificação in vitro 8 , 9 , 10 , 11 . Além do satelliTe células, os músculos esqueléticos também contêm muitas outras populações de células com potencial miogénico 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , tais como as células intersticiais positivas ao receptor de factor de crescimento derivado de plaquetas beta (PDGFRp). Há evidências que demonstram que as células PDGFRβ + derivadas de músculo são capazes de se diferenciar em células miogênicas e melhorar a patologia e a função muscular 14 , 17 , 18 , 19 , 20 . O PDGFRβ rotula predominantemente os pericitos 21 , que são células perivasculares com pluripotência 22 , 23 . Além de PDGFRβ, muitos outros marcadores, incluindo Neuron-Glial 2 (NG2) e CD146, também são usados ​​para iDentify pericytes 21 . Deve-se notar, no entanto, que nenhum desses marcadores é pericítico-específico [ 21] . Estudos recentes revelaram dois subtipos de pericitos musculares, chamados de tipo I e tipo II, que expressam marcadores moleculares diferentes e exercem funções distintas 19 , 24 , 25 . Bioquimicamente, os pericitos do tipo I são NG2 + Nestin , enquanto os pericídios do tipo II são NG2 + Nestin + 19 , 24 . Funcionalmente, os pericitos tipo I podem sofrer diferenciação adipogênica, contribuindo para acúmulo de gordura e / ou fibrose, enquanto que os pericitos de tipo II podem se diferenciar ao longo da via miogênica, contribuindo para a regeneração muscular 19 , 24 , 25 . Estes resultados demonstram que: (1) os pericitos de tipo I podem bE alvo no tratamento de transtornos degenerativos gordos / fibrose, e (2) pericitos de tipo II têm grande potencial terapêutico para a distrofia muscular. Outras investigações e caracterização destas populações requerem um protocolo de isolamento que permita a separação dos pericitos tipo I e tipo II com alto grau de pureza.

Atualmente, o isolamento de subpopulações pericíticas depende de camundongos duplamente transgênicos NG2-DsRed e Nestin-GFP 19,24. A disponibilidade de ratinhos NG2-DsRed ea qualidade da maioria dos anticorpos NG2 limitam o uso generalizado deste método. Dado que todos os pericitos NG2 + também expressam PDGFRβ nos músculos esqueléticos 19 , 20 , 24 , hipótese de que NG2 pode ser substituído por PDGFRβ para o isolamento de pericitos e suas subpopulações. Este trabalho descreve um protocolo baseado em FACS queUtiliza a coloração PDGFRβ e o sinal Nestin-GFP. Este método é menos exigente para os investigadores porque: (1) não requer o fundo NG2-DsRed e (2) utiliza anticorpos PDGFRβ comercialmente disponíveis, que são bem caracterizados. Além disso, permite o isolamento simultâneo de pericitos tipo I e tipo II com elevada pureza, permitindo uma investigação mais aprofundada da biologia e potencial terapêutico destas subpopulações de pericitos. Após purificação, estas células podem ser cultivadas em cultura, e as suas morfologias podem ser visualizadas. Este trabalho também mostra que os pericitos tipo I e tipo II isolados usando este método, como os purificados a partir de camundongos duplamente transgênicos, são adipogênicos e miogênicos, respectivamente.

Protocol

Os ratinhos transgénicos de tipo selvagem e Nestin-GFP foram alojados na instalação animal na Universidade de Minnesota. Todos os procedimentos experimentais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Minnesota e estavam de acordo com o Guia do NIH para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório. 1. Dissecção muscular e isolamento de célula única Euthanize camundongos adultos (6-10 semanas, ambos do sexo masculino e feminino) …

Representative Results

Os parâmetros FACS, incluindo a intensidade do laser e a compensação do canal, são corrigidos com base nos resultados de controles sem cor e controles de cor única. O controlo PDGFRβ-PE-FMO é utilizado para definir o gating para a população de PDGFRβ-PE + ( Figura 1A ). Entre as células PDGFRβ-PE, duas populações que representam as células Nestin-GFP + e Nestin-GFP estão claramente separadas ( Figura…

Discussion

Os pericitos são células perivasculares multipotentes 22 , 23 localizadas na superfície abluminal dos capilares 21 , 26 . Nos músculos esqueléticos, os pericitos são capazes de diferenciar ao longo das vias adipogénicas e / ou miogénicas 19 , 20 , 24 . Estudos recentes revelaram duas subpopulações de p…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi parcialmente apoiado por um Fundo-A-Fellow subvenção da Myotonic Dystrophy Foundation (MDF-FF-2014-0013) eo Cientista Development Grant da American Heart Association (16SDG29320001).

Materials

Cell Sorter Sony SH800
Automatic Setup Beads Sony LE-B3001
DMEM Gibco 11995
Avertin  Sigma T48402
Pericyte Growth Medium ScienCell 1201
MSC Basal Medium (Mouse) Stemcell Technologies 5501
Adipogenic Stimulatory Supplement (Mouse) Stemcell Technologies 5503
Fetal Bovine Serum Gibco 16000
Horse Serum Sigma H1270
Collagenase Type 2 Worthington LS004176
0.25% Trypsin/EDTA  Gibco 25200
Penicillin/Streptomycin Gibco 15140
PDL Sigma P6407
PDGFRβ-PE Antibody eBioscience 12-1402
Perilipin Antibody Sigma P1998
S-Myosin Antibody DSHB MF-20
Alexa 555-anti-rabbit antibody  ThermoFisher Scientific A-31572
Alexa 555-anti-mouse antibody ThermoFisher Scientific A-31570
Mounting Medium with DAPI Vector Laboratories H-1200
DAPI ThermoFisher Scientific D1306
HEPES Gibco 15630
EDTA Fisher BP120
BSA Sigma A2058
NH4Cl Fisher Scientific A661
KHCO3 Fisher Scientific P184
PBS Gibco 14190
18G Needles BD 305196
10ml Serological Pipette BD 357551

References

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Nirwane, A., Gautam, J., Yao, Y. Isolation of Type I and Type II Pericytes from Mouse Skeletal Muscles. J. Vis. Exp. (123), e55904, doi:10.3791/55904 (2017).

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