Summary

Выделение перицитов типа I и типа II из мышечных скелетных мышц

Published: May 26, 2017
doi:

Summary

Эта работа описывает протокол на основе FACS, который позволяет легко и одновременно изолировать перициты типа I и типа II от скелетных мышц.

Abstract

Перициты являются периваскулярными мультипотентными клетками, которые проявляют гетерогенность в разных органах или даже в пределах одной и той же ткани. В скелетных мышцах есть по крайней мере две субпопуляции перицитов (так называемые тип I и тип II), которые экспрессируют различные молекулярные маркеры и обладают отличными возможностями дифференциации. С использованием двойных трансгенных мышей NG2-DsRed и Nestin-GFP успешно прошли выделение перициты типа I (NG2-DsRed + Nestin-GFP ) и типа II (NG2-DsRed + Nestin-GFP + ). Однако доступность этих двойных трансгенных мышей предотвращает широкое использование этого метода очистки. Эта работа описывает альтернативный протокол, который позволяет легко и одновременно изолировать перициты типа I и типа II от скелетных мышц. Этот протокол использует технологию сортировки с активированной флуоресценцией клеток (FACS) и нацелен на PDGFRβ, а не NG2 вместе с сигналом Nestin-GFP. После изоляции введите I и tyПерициты пе II обладают отчетливыми морфологиями. Кроме того, перициты I и II типа, выделенные этим новым методом, как, например, выделенные из двойных трансгенных мышей, являются адипогенными и миогенными соответственно. Эти результаты позволяют предположить, что этот протокол может быть использован для выделения субпопуляций перицитов из скелетных мышц и, возможно, из других тканей.

Introduction

Мышечная дистрофия – дегенеративное расстройство мышц, которое пока не имеет эффективных методов лечения. Развитие терапии, способствующей регенерации тканей, всегда вызывало большой интерес. Регенерация и восстановление тканей после повреждения зависят от резидентных стволовых клеток / клеток-предшественников 1 . Сателлитные клетки представляют собой миогенные клетки-предшественники, которые способствуют регенерации мышц 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 . Их клиническое применение, однако, затруднено их ограниченной миграцией и низкой выживаемостью после инъекции, а также их пониженной способностью к дифференцировке после амплификации in vitro 8 , 9 , 10 , 11 . В дополнение к спутникамTe клетки, скелетные мышцы также содержат много других клеточных популяций с миогенным потенциалом 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , таких как тромбоцитарные рецепторы-бета (PDGFRβ) -положительные интерстициальные клетки. Имеются данные, свидетельствующие о том, что полученные из мышцы PDGFRβ + клетки способны дифференцироваться в миогенные клетки и улучшать мышечную патологию и функцию 14 , 17 , 18 , 19 , 20 . PDGFRβ преимущественно обозначает перициты 21 , которые являются периваскулярными клетками с плюрипотентностью 22 , 23 . В дополнение к PDGFRβ, многие другие маркеры, включая Neuron-Glial 2 (NG2) и CD146, также используются для iУточнить перициты 21 . Следует отметить, однако, что ни один из этих маркеров не зависит от перицитов. 21 . Недавние исследования выявили два подтипа перицитов мышц, называемых типом I и типом II, которые экспрессируют различные молекулярные маркеры и выполняют различные функции 19 , 24 , 25 . Биохимически перициты I типа – NG2 + Nestin , а перициты II типа – NG2 + Nestin + 19 , 24 . Функционально перициты I типа могут подвергаться адипогенной дифференцировке, способствуя накоплению жира и / или фиброзу, тогда как перициты II типа могут дифференцироваться вдоль миогенного пути, способствуя регенерации мышц 19 , 24 , 25 . Эти результаты показывают, что: (1) перициклы типа I могут bЕ, предназначенные для лечения жировых дегенеративных расстройств / фиброза, и (2) перициты II типа обладают большим терапевтическим потенциалом для мышечной дистрофии. Для дальнейшего изучения и характеристики этих популяций требуется протокол изоляции, который позволяет разделять перициты типа I и типа II с высоким уровнем чистоты.

В настоящее время выделение субпопуляций перицитов основано на двойных трансгенных мышах NG2-DsRed и Nestin-GFP 19 , 24 . Наличие мышей NG2-DsRed и качество большинства NG2-антител ограничивают широкое использование этого метода. Учитывая, что все NG2 + перициты также экспрессируют PDGFRβ в скелетных мышцах 19 , 20 , 24 , мы предполагаем, что NG2 можно заменить PDGFRβ для выделения перицитов и их субпопуляций. В этой работе описывается протокол на основе FACS, которыйИспользует окрашивание PDGFRβ и сигнал Nestin-GFP. Этот метод менее требователен для исследователей, поскольку: (1) он не требует фона NG2-DsRed и (2) он использует коммерчески доступные антитела PDGFRβ, которые хорошо охарактеризованы. Кроме того, он обеспечивает одновременную изоляцию перицитов типа I и типа II с высокой степенью чистоты, что позволяет провести дальнейшее изучение биологии и терапевтического потенциала этих субпопуляций перицитов. После очистки эти клетки можно выращивать в культуре, и их морфологии можно визуализировать. Эта работа также показывает, что перициты типа I и типа II, выделенные с использованием этого метода, подобно очищенным от двойных трансгенных мышей, являются адипогенными и миогенными соответственно.

Protocol

Трансгенных мышей дикого типа и Nestin-GFP размещали на объекте для животных в Университете Миннесоты. Все экспериментальные процедуры были одобрены Институциональным комитетом по уходу и использованию животных при Университете Миннесоты и были в соответствии с Руководством по уходу и и…

Representative Results

Параметры FACS, включая интенсивность лазера и коррекцию канала, корректируются на основе результатов контроля без контроля и одноцветного управления. Управление PDGFRβ-PE-FMO используется для установки стробирования для популяции PDGFRβ-PE + ( рисунок 1A )…

Discussion

Перициты являются мультипотентными периваскулярными клетками 22 , 23 , расположенными на абляминальной поверхности капилляров 21 , 26 . В скелетных мышцах перициты способны дифференцироваться по адипогенным и / или миогенным …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была частично поддержана грантом Фонда-Фонда Фонда диетологии Myotonic Dystrophy (MDF-FF-2014-0013) и гранта на развитие науки от Американской кардиологической ассоциации (16SDG29320001).

Materials

Cell Sorter Sony SH800
Automatic Setup Beads Sony LE-B3001
DMEM Gibco 11995
Avertin  Sigma T48402
Pericyte Growth Medium ScienCell 1201
MSC Basal Medium (Mouse) Stemcell Technologies 5501
Adipogenic Stimulatory Supplement (Mouse) Stemcell Technologies 5503
Fetal Bovine Serum Gibco 16000
Horse Serum Sigma H1270
Collagenase Type 2 Worthington LS004176
0.25% Trypsin/EDTA  Gibco 25200
Penicillin/Streptomycin Gibco 15140
PDL Sigma P6407
PDGFRβ-PE Antibody eBioscience 12-1402
Perilipin Antibody Sigma P1998
S-Myosin Antibody DSHB MF-20
Alexa 555-anti-rabbit antibody  ThermoFisher Scientific A-31572
Alexa 555-anti-mouse antibody ThermoFisher Scientific A-31570
Mounting Medium with DAPI Vector Laboratories H-1200
DAPI ThermoFisher Scientific D1306
HEPES Gibco 15630
EDTA Fisher BP120
BSA Sigma A2058
NH4Cl Fisher Scientific A661
KHCO3 Fisher Scientific P184
PBS Gibco 14190
18G Needles BD 305196
10ml Serological Pipette BD 357551

References

  1. Rennert, R. C., Sorkin, M., Garg, R. K., Gurtner, G. C. Stem cell recruitment after injury: lessons for regenerative medicine. Regenerative medicine. 7 (6), 833-850 (2012).
  2. Sambasivan, R., et al. Pax7-expressing satellite cells are indispensable for adult skeletal muscle regeneration. Development. 138 (17), 3647-3656 (2011).
  3. Relaix, F., Zammit, P. S. Satellite cells are essential for skeletal muscle regeneration: the cell on the edge returns centre stage. Development. 139 (16), 2845-2856 (2012).
  4. von Maltzahn, J., Jones, A. E., Parks, R. J., Rudnicki, M. A. Pax7 is critical for the normal function of satellite cells in adult skeletal muscle. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (41), 16474-16479 (2013).
  5. Lepper, C., Partridge, T. A., Fan, C. M. An absolute requirement for Pax7-positive satellite cells in acute injury-induced skeletal muscle regeneration. Development. 138 (17), 3639-3646 (2011).
  6. Kuang, S., Charge, S. B., Seale, P., Huh, M., Rudnicki, M. A. Distinct roles for Pax7 and Pax3 in adult regenerative myogenesis. J Cell Biol. 172 (1), 103-113 (2006).
  7. Murphy, M. M., Lawson, J. A., Mathew, S. J., Hutcheson, D. A., Kardon, G. Satellite cells, connective tissue fibroblasts and their interactions are crucial for muscle regeneration. Development. 138 (17), 3625-3637 (2011).
  8. Morgan, J. E., Pagel, C. N., Sherratt, T., Partridge, T. A. Long-term persistence and migration of myogenic cells injected into pre-irradiated muscles of mdx mice. J Neurol Sci. 115 (2), 191-200 (1993).
  9. Beauchamp, J. R., Morgan, J. E., Pagel, C. N., Partridge, T. A. Dynamics of myoblast transplantation reveal a discrete minority of precursors with stem cell-like properties as the myogenic source. J Cell Biol. 144 (6), 1113-1122 (1999).
  10. Partridge, T. A. Invited review: myoblast transfer: a possible therapy for inherited myopathies. Muscle Nerve. 14 (3), 197-212 (1991).
  11. Montarras, D., et al. Direct isolation of satellite cells for skeletal muscle regeneration. Science. 309 (5743), 2064-2067 (2005).
  12. Asakura, A., Seale, P., Girgis-Gabardo, A., Rudnicki, M. A. Myogenic specification of side population cells in skeletal muscle. J Cell Biol. 159 (1), 123-134 (2002).
  13. Tamaki, T., et al. Skeletal muscle-derived CD34+/45- and CD34-/45- stem cells are situated hierarchically upstream of Pax7+ cells. Stem Cells Dev. 17 (4), 653-667 (2008).
  14. Dellavalle, A., et al. Pericytes resident in postnatal skeletal muscle differentiate into muscle fibres and generate satellite cells. Nat Commun. 2, 499 (2011).
  15. Mitchell, K. J., et al. Identification and characterization of a non-satellite cell muscle resident progenitor during postnatal development. Nat Cell Biol. 12 (3), 257-266 (2010).
  16. Pannerec, A., Formicola, L., Besson, V., Marazzi, G., Sassoon, D. A. Defining skeletal muscle resident progenitors and their cell fate potentials. Development. 140 (14), 2879-2891 (2013).
  17. Dellavalle, A., et al. Pericytes of human skeletal muscle are myogenic precursors distinct from satellite cells. Nat Cell Biol. 9 (3), 255-267 (2007).
  18. Kostallari, E., et al. Pericytes in the myovascular niche promote post-natal myofiber growth and satellite cell quiescence. Development. 142 (7), 1242-1253 (2015).
  19. Birbrair, A., et al. Role of pericytes in skeletal muscle regeneration and fat accumulation. Stem Cells Dev. 22 (16), 2298-2314 (2013).
  20. Yao, Y., Norris, E. H., Mason, C. E., Strickland, S. Laminin regulates PDGFRbeta(+) cell stemness and muscle development. Nat Commun. 7, 11415 (2016).
  21. Armulik, A., Genove, G., Betsholtz, C. Pericytes: developmental, physiological, and pathological perspectives, problems, and promises. Dev Cell. 21 (2), 193-215 (2011).
  22. Dore-Duffy, P. Pericytes: pluripotent cells of the blood brain barrier. Curr Pharm Des. 14 (16), 1581-1593 (2008).
  23. Dore-Duffy, P., Katychev, A., Wang, X., Van Buren, E. CNS microvascular pericytes exhibit multipotential stem cell activity. J Cereb Blood Flow Metab. 26 (5), 613-624 (2006).
  24. Birbrair, A., et al. Skeletal muscle pericyte subtypes differ in their differentiation potential. Stem Cell Res. 10 (1), 67-84 (2013).
  25. Gautam, J., Nirwane, A., Yao, Y. Laminin differentially regulates the stemness of type I and type II pericytes. Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 28 (2017).
  26. Birbrair, A., et al. Pericytes: multitasking cells in the regeneration of injured, diseased, and aged skeletal muscle. Front Aging Neurosci. 6, 245 (2014).

Play Video

Cite This Article
Nirwane, A., Gautam, J., Yao, Y. Isolation of Type I and Type II Pericytes from Mouse Skeletal Muscles. J. Vis. Exp. (123), e55904, doi:10.3791/55904 (2017).

View Video