Summary

الفلورة الكمية لقياس عالمية مترجمة ترجمة

Published: August 22, 2017
doi:

Summary

هذه المخطوطة وصف أسلوب لتصور وتحديد الأحداث الترجمة المترجمة في المقصورات سوبسيلولار. يتطلب نظام تصوير [كنفوكل] أساسية والمواد الكاشفة النهج المقترح في هذه المخطوطة وهي سريعة وفعالة من حيث التكلفة.

Abstract

الآليات التي تنظم الترجمة مرناً وتشارك في مختلف العمليات البيولوجية، مثل جرثومة خط التنمية وتمايز الخلايا وأورجانوجينيسيس، وكذلك في العديد من الأمراض. وقد أظهرت العديد من المنشورات مقنع أن آليات محددة تنظم أحكام الترجمة مرناً. زيادة الاهتمام بتنظيم تعبير البروتينات المستحثة بالترجمة أدى إلى استحداث طرق جديدة لدراسة ومتابعة حيثياته البروتين التوليف في سيلولو. ومع ذلك، معظم هذه الأساليب معقدة ويجعلها مكلفة وكثيراً ما يحد من عدد أهداف مرناً التي يمكن دراستها. وتقترح هذه المخطوطة أسلوب الذي يتطلب فقط الكواشف الأساسية ونظام تصوير الأسفار [كنفوكل] قياس ووضع تصور للتغيرات التي تحدث في أي خط الخلية تحت ظروف مختلفة في الترجمة مرناً. واستخدمت هذا الأسلوب مؤخرا لإظهار الترجمة المترجمة في الهياكل سوبسيلولار الخلايا ملتصقة على مدى فترة قصيرة من الوقت، مما يتيح إمكانية تصور الترجمة حيثياته لفترة قصيرة من خلال مجموعة متنوعة من البيولوجية العمليات أو التحقق من صحة التغييرات في النشاط متعدية الجنسيات في الاستجابة للمحفزات محددة.

Introduction

تنظيم الترجمة بمختلف الوظائف الخلوية ودفعت العديد من فرق البحث لتطوير أدوات جديدة وأساليب لتحديد التعريب سوبسيلولار الترجمة مرناً وتنظم البروتين التوليف1،2 ،،من34. تسمح هذه التطورات التكنولوجية الحديثة لتحسين فهم الآليات التي تنطوي على أوبريجولاتيون الترجمة أو قمع مرناس محددة خلال العمليات البيولوجية، مثل تنمية الخلايا العصبية والمخدرات واستجابة وورم خبيث5 6، ،،من78. ومع ذلك، تتطلب معظم هذه الطرق مكلفة أو الخطرة والمواد الكيميائية ومعدات معينة قد لا تكون متاحة لمعظم المختبرات. على هذا النحو، قد وضعت طريقة فعالة من حيث التكلفة للسماح للتقييم السريع للأحداث الترجمة للتحايل على وجه التحديد هذه القضايا المحتملة. هذا الأسلوب يكشف التحويرات متعدية الحادة التي تحدث أثناء العمليات الخلوية المحددة ويسمح أيضا لإضفاء الطابع المحلي على الترجمة باستخدام الفحص المجهري [كنفوكل].

واستخدمت الأساليب الموصوفة هنا لرصد الترجمة المترجمة داخل مقصورات سوبسيلولار تسمى الشروع في نشر مراكز (SIC)5. سيكس هي عابرة الهياكل الموجودة في خلايا المصنف التي يتم ترجمتها على رأس المجمعات التصاق الوليدة. رغم سايكس ومجمعات التصاق متميزة، ترتبط ارتباطاً وثيقا مصائرهم. وفي الواقع، معروفة سايكس تختفي تدريجيا عند نضوج التصاق المحورية المعقدة إلى موقع التصاق خلال المرحلة الأولية للالتصاق. وجدنا أن الجيش الملكي النيبالي ملزم البروتينات المعروفة للسيطرة على وجه التحديد مرناً الترجمة (مثلاً، Sam68، فمرب، و G3BP1) وبوليادينيلاتيد وقد أثري الكشف داخل هذه الهياكل5. باستخدام الأساليب الموضحة هنا، أظهرنا أن تنظيم مرناً SIC المرتبطة بمثابة الترجمة السماح بتفتيش المصنف الخلايا توطيد التصاق الخلية. ويمكن اعتبار هذا الأسلوب، استناداً إلى التأسيس بوروميسين، صيغة معدلة للاستشعار السطحية للمقايسة الترجمة (غروب الشمس). وضعت أصلاً لقياس معدلات توليف البروتين العالمية باستخدام الأحماض الأمينية مسماة غير إشعاعيا، بوروميسيليشن البروتين يوفر طريقة فعالة لتصور حيثياته البروتين التوليف9. يعتمد هذا الأسلوب على السلوك الجوهرية من بوروميسين، مضاد كتل الترجمة عن طريق إنهاء سلسلة سابقة لأوانها في الريبوسوم10. وفي الواقع، بوروميسين يماثل هيكلياً تيروسيل-الحمض الريبي النووي النقال، يسمح لإدماجها في سلاسل ببتيد عبر تشكيل السندات ببتيد التمطيط. بيد بوروميسين ملزم لسلسلة ببتيد متزايد يمنع سندات ببتيد جديدة يجري تشكيلها بالقادم أمينواسيل-الحمض الريبي النووي النقال، منذ بوروميسين سندات غير هيدروليسابل أميد بدلاً من السندات إستر هيدروليسابل وجدت في ترنس. وهكذا يؤدي إدماج بوروميسين في التمطيط البروتينية في إصدار سابق لأوانه عديدة بوروميسيلاتيد مبتوراً البروتينية المقابلة لترجمتها بنشاط مرناً9،11،12 .

باستخدام هذا الأسلوب، كان من الممكن لتقييم الترجمة النشطة خلال وقت قصير أرملة (مثلاً 5 دقائق) خلال الالتصاق الخلوي استخدام جسم محددة موجهة ضد بوروميسين في الخلايا التي استكملت بالمضادات الحيوية لفترات 5-دقيقة في نقاط زمنية مختلفة خلال عملية التصاق الخلية5. دقة هذا الفحص يعتمد على أجسام مضادة محددة للغاية الموجهة ضد مجموعة بوروميسيلاتيد. ويوفر اكتشاف ببتيد بوروميسيلاتيد إيممونوفلوريسسينت إعادة تقسيم سوبسيلولار عامة مرناً المترجمة حديثا، التي يمكن قياسها كمياً بدقة كبيرة باستخدام نظم التصوير [كنفوكل] أيضا.

ومن ثم، يقدم هذا الأسلوب خيار المناسب لعدد كبير من المختبرات التي تدرس آليات تنظيمية متعدية الجنسيات المشاركة في العمليات مثل تحبيب العصبية6،،من1314، 15ومورفوجين مرناً التعريب والترجمة خلال التنمية16،17. وأيضا مناسب تماما لدراسة الترجمة المترجمة أو المجزأة أثناء الأحداث البيولوجية السريعة، مثل الهجرة الخلية أو الالتصاق أو الغزو، أو لمجرد تقييم العلاج بالعقاقير التي قد تسبب التغييرات متعدية5، 7 , 18-وعموما، يسمح هذا الأسلوب لتصور الأحداث الترجمة المترجمة أو التي تسيطر عليها بطريقة سريعة ودقيقة وفعالة من حيث التكلفة.

Protocol

1-“تحديد شروط بوروميسيليشن” ملاحظة: هذا الأسلوب توضح هذه المقالة الطريقة المستخدمة لتقييم الترجمة المترجمة خلال عملية التصاق الخلايا لجنة نهر الميكونج–5 5. كما يمكن أن يتم بوروميسيليشن في أي خلية، من المهم تحسين شروط بوروميسيليشن خطوط خلية معينة لاستخدامها، لأ…

Representative Results

لدقة مراقبة أحداث الترجمة باستخدام إدراج بوروميسين، من الأهمية بمكان لتحديد الظروف المثلى لكل خط الخلية لأنه يظهر كل بوروميسين مختلفة إدماج حركية (الشكل 1)9،11 ،،من1218. ومن ثم، للتحقق م?…

Discussion

وأتاحت التطورات التكنولوجية الحديثة لفهم أفضل لآليات المشاركة في upregulation متعدية الجنسيات أو قمع مرناس محددة في العمليات البيولوجية، مثل تنمية الخلايا العصبية والمخدرات واستجابة وورم خبيث. منهجية فعالة من حيث التكلفة الموضحة هنا يسمح لترجمة الأحداث تصور في الخلايا لدراسة كيف البروتينات …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

ونحن نشكر الدكتور رشيد المزروعي (جامعة لافال، كيبيك، كندا) لقراءة نقدية من المخطوطة. ونحن نشكر “وحدة التصوير الخلية” التابعة لمركز البحوث الخاصة بالمساعدة التقنية. هوت م. É. هو أحد علماء البحوث 1 جونيور دي فوندز بحوث دو كيبيك والصحة (فرق-S). هذا العمل كان يدعمها “المعاهد الكندية للبحوث الصحية” (منح عدد استوفوا، 286437 اجتماع الأطراف أن É م. هوت).

Materials

DMEM wisent 319-005-CL
Trypsine wisent 325-043 EL
FBS Thermo Fisher Scientific 12483020
Puroycin antibody 12D10 EMD millipore MABE343 western blot dilution 1:25000
Immunofluoresence dilution 1:10000
Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody cell signaling technology 7076 western blot dilution 1:8000
Western Lightning Plus-ECL Perkin Elmer NEL104001EA
Anti-mouse IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor 488 Conjugate) cell signaling technology 4408 immunofluoresecence dilution 1:400
CF568 Phalloidin biotium 00044 immunofluoresecence dilution 1:400
Cyclohexmide Sigma C1988-1G 50µg/ml final concentration
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) Invitrogen D1306 final concentration 1µg/ml
Puromycin bio-Basic PJ593 2.5µg/ml to 10µg/ml
Ibidi µ-Dish 35 mm, high, ibiTreat Ibidi 81156
MRC-5 cells ATCC CCL-171
HeLa cells ATCC CCL-2
Huh-7 cells from Dr. Mazroui (Université Laval)
Fv1000 olympus confocal imaging system
Fiji software http://fiji.sc
PBS (Phosphate BuffeRed Saline) bio-Basic PD8117
Formaldehyde 37% Solution bio-Basic C5300-1
Triton X-100 bio-Basic TB0198
BSA Fisher Bioreagents BP9702-100
Tween20 Fisher Bioreagents BP337-500

References

  1. Yan, X., Hoek, T. A., Vale, R. D., Tanenbaum, M. E. Dynamics of Translation of Single mRNA Molecules In Vivo. Cell. 165, 976-989 (2016).
  2. Morisaki, T., et al. Real-time quantification of single RNA translation dynamics in living cells. Science. 352, 1425-1429 (2016).
  3. Wu, B., Eliscovich, C., Yoon, Y. J., Singer, R. H. Translation dynamics of single mRNAs in live cells and neurons. Science. 352, 1430-1435 (2016).
  4. Halstead, J. M., et al. TRICK: A Single-Molecule Method for Imaging the First Round of Translation in Living Cells and Animals. Methods Enzymol. 572, 123-157 (2016).
  5. Bergeman, J., Caillier, A., Houle, F., Gagne, L. M., Huot, M. E. Localized translation regulates cell adhesion and transendothelial migration. J Cell Sci. 129, 4105-4117 (2016).
  6. El Fatimy, R., et al. Tracking the Fragile X Mental Retardation Protein in a Highly Ordered Neuronal RiboNucleoParticles Population: A Link between Stalled Polyribosomes and RNA Granules. PLoS Genet. 12, e1006192 (2016).
  7. Adjibade, P., et al. Sorafenib, a multikinase inhibitor, induces formation of stress granules in hepatocarcinoma cells. Oncotarget. 6, 43927-43943 (2015).
  8. Paronetto, M. P., et al. Sam68 regulates translation of target mRNAs in male germ cells, necessary for mouse spermatogenesis. J Cell Biol. 185, 235-249 (2009).
  9. Schmidt, E. K., Clavarino, G., Ceppi, M., Pierre, P. S. U. n. S. E. T. SUnSET, a nonradioactive method to monitor protein synthesis. Nat Methods. 6, 275-277 (2009).
  10. Azzam, M. E., Algranati, I. D. Mechanism of puromycin action: fate of ribosomes after release of nascent protein chains from polysomes. Proc Natl Acad Sci U S A. 70, 3866-3869 (1973).
  11. Goodman, C. A., Hornberger, T. A. Measuring protein synthesis with SUnSET: a valid alternative to traditional techniques. Exerc Sport Sci Rev. 41, 107-115 (2013).
  12. David, A., et al. Nuclear translation visualized by ribosome-bound nascent chain puromycylation. J Cell Biol. 197, 45-57 (2012).
  13. Fallini, C., Bassell, G. J., Rossoll, W. Spinal muscular atrophy: the role of SMN in axonal mRNA regulation. Brain Res. 1462, 81-92 (2012).
  14. Costa-Mattioli, M., et al. Translational control of hippocampal synaptic plasticity and memory by the eIF2alpha kinase GCN2. Nature. 436, 1166-1173 (2005).
  15. Costa-Mattioli, M., Sossin, W. S., Klann, E., Sonenberg, N. Translational control of long-lasting synaptic plasticity and memory. Neuron. 61, 10-26 (2009).
  16. Du, T. G., Schmid, M., Jansen, R. P. Why cells move messages: the biological functions of mRNA localization. Semin Cell Dev Biol. 18, 171-177 (2007).
  17. Ephrussi, A., St Johnston, D. Seeing is believing: the bicoid morphogen gradient matures. Cell. 116, 143-152 (2004).
  18. Mardakheh, F. K., et al. Global Analysis of mRNA, Translation, and Protein Localization: Local Translation Is a Key Regulator of Cell Protrusions. Dev Cell. 35, 344-357 (2015).
  19. Lacsina, J. R., et al. Premature translational termination products are rapidly degraded substrates for MHC class I presentation. PLoS One. 7, e51968 (2012).
  20. Schneider-Poetsch, T., et al. Inhibition of eukaryotic translation elongation by cycloheximide and lactimidomycin. Nat Chem Biol. 6, 209-217 (2010).
  21. Jacobs, J. P., Jones, C. M., Baille, J. P. Characteristics of a human diploid cell designated MRC-5. Nature. 227, 168-170 (1970).
  22. Gandin, V., et al. Polysome fractionation and analysis of mammalian translatomes on a genome-wide scale. J Vis Exp. (87), (2014).

Play Video

Cite This Article
Bergeman, J., Huot, M. Quantitative Immunofluorescence to Measure Global Localized Translation. J. Vis. Exp. (126), e55909, doi:10.3791/55909 (2017).

View Video