La inmunofluorescencia cuantitativa a medida Global localizada traducción
Summary
Este manuscrito describe un método para visualizar y cuantificar eventos traducción localizada en compartimientos subcelulares. El enfoque propuesto en este manuscrito requiere un sistema de proyección de imagen confocal básico y reactivos y es rápida y rentable.
Abstract
Los mecanismos de regulación de la traducción del mRNA están implicados en varios procesos biológicos, como el desarrollo de líneas germinales, diferenciación celular y organogénesis, así como en múltiples enfermedades. Numerosas publicaciones han demostrado convincentemente que mecanismos específicos bien regulan la traducción del mRNA. Creciente interés en la regulación inducida por la traducción de la expresión de la proteína ha llevado al desarrollo de nuevos métodos para estudiar y seguir de nuevo proteína síntesis de cellulo. Sin embargo, la mayoría de estos métodos es compleja, haciéndolos costosos y a menudo limitar el número de objetivos de mRNA que pueden estudiarse. Este manuscrito propone un método que requiere sólo reactivos básicos y un sistema de imagen confocal de la fluorescencia para medir y visualizar los cambios en la traducción de ARNm que se producen en cualquier línea celular en diversas condiciones. Este método fue utilizado recientemente para mostrar traducción localizada en las estructuras subcelulares de las células adherentes durante un período corto de tiempo, ofreciendo así la posibilidad de visualizar traducción de novo durante un corto período durante una variedad de biológico procesos o de validar cambios en actividad traslacional en respuesta a estímulos específicos.
Introduction
La regulación de la traducción de diversas funciones celulares ha llevado a muchos equipos de investigación para desarrollar nuevas herramientas y métodos para determinar la localización subcelular de la traducción del mRNA y proteína regulada síntesis1,2 ,3,4. Estos avances tecnológicos recientes permiten una mejor comprensión de los mecanismos que implican el upregulation de la traducción o la represión de los mRNAs específicos durante los procesos biológicos, como el desarrollo neuronal, la respuesta de la droga y metástasis5 ,6,7,8. Sin embargo, la mayoría de estos métodos requieren reactivos caros o peligrosos y equipamiento específico que podría no estar disponible para la mayoría de los laboratorios. Como tal, fue desarrollado un método rentable para permitir la evaluación rápida de los eventos de traducción para específicamente evitar estos posibles problemas. Este método detecta agudas modulaciones traslacionales que se producen durante procesos celulares específicos y también permite la localización de la traducción usando microscopia confocal.
Se utilizaron los métodos descritos aquí para supervisar la traducción localizada dentro de compartimentos subcelulares llamado difusión de centros (SIC) de iniciación5. SICs son estructuras transitorias encontradas células sembradas que se localizan encima de los complejos de adhesión naciente. Aunque SICs y complejos de adhesión son distintos, sus destinos están íntimamente ligados. De hecho, SICs conocen a desaparecer poco a poco sobre maduración complejos de adhesión focal en un sitio de adherencia durante la fase inicial de adhesión. Hemos encontrado que las proteínas de unión de ARN conocidas para controlar específicamente la traducción del mRNA (p. ej., Sam68, FMRP y G3BP1) y cofia RNAs fueron enriquecidos dentro de estas estructuras5. Utilizando los métodos descritos aquí, demostramos que la regulación del mRNA SIC asociados traducción actúa como un punto de control que permite sembrar células para consolidar la adhesión celular. Este método, basado en la incorporación de puromicina, podría considerarse una versión adaptada de la detección superficial de prueba de traducción (SunSET). Originalmente desarrollado para medir las tasas de síntesis de proteína global utilizando un aminoácido marcado no radiactivo, proteína puromycilation ofrece una manera eficiente para visualizar de novo de síntesis de proteínas9. Este método se basa en el comportamiento intrínseco de puromicina, un antibiótico que bloquea la traducción a través de terminación prematura de la cadena en el ribosoma10. De hecho, la puromicina es estructuralmente análogo a Tirosil-ARNt, que permite la incorporación en alargar las cadenas de péptido a través de la formación de un enlace peptídico. Sin embargo, Unión de puromicina a una cadena creciente del peptide impide que un nuevo enlace peptídico formándose con el aminoacil-tRNA siguiente, puesto que la puromicina tiene un enlace de amida no hidrolizable en vez del enlace de éster hidrolizable en tRNAs. Así, la incorporación de puromicina alarga polipéptidos resulta en la liberación prematura de numerosos polipéptidos puromycilated truncada correspondiente a mRNA activamente traducido9,11,12 .
Usando este método, fue posible evaluar la traducción activa dentro de una viuda de corto plazo (por ejemplo, 5 minutos) durante la adhesión celular usando un anticuerpo específico contra puromicina en células que fueron complementados con el antibiótico durante períodos de 5 minutos en diferentes momentos durante la adhesión celular proceso5. La precisión de este ensayo se basa en anticuerpos altamente específicos dirigidos contra la molécula de puromycilated. Detección inmunofluorescente del polipéptido puromycilated proporciona una distribución subcelular general del mRNA recién traducida, que también se puede cuantificar con gran precisión utilizando sistemas de proyección de imagen confocales.
Por lo tanto, este método ofrece una opción relevante para un gran número de laboratorios estudio traslacionales mecanismos implicados en procesos como la granulación neuronal6,13,14, 15, morfogen mRNA, traducción y localización durante el desarrollo de16,17. También es idóneo para estudiar traducción localizada o compartimentada durante rápidos acontecimientos biológicos, como la migración celular, adherencia o invasión, o simplemente evaluar los tratamientos con fármacos que pueden inducir cambios traslacional5, 7 , 18. en general, este método permite la visualización de eventos de traducción localizada o controlados de una manera rápida, precisa y rentable.
Protocol
Representative Results
Discussion
Avances tecnológicos recientes han permitido una mejor comprensión de los mecanismos implicados en el upregulation traslacional o la represión de los mRNAs específicos en procesos biológicos, como metástasis, respuesta de la droga y desarrollo neuronal. La metodología rentable aquí descrita permite eventos de traducción para ser visualizados en las células para el estudio de cómo las proteínas RNA-que ata regulan procesos metastásicos, como la adhesión celular, la migración y la invasión.
<p class="jo…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Dr. Rachid Mazroui (Université Laval, Québec, Canadá) para la lectura crítica del manuscrito. Agradecemos a la unidad de la proyección de imagen del celular del centro de investigación para su asistencia técnica. É M. Huot es becario de investigación Junior 1 de Fonds de Recherche du Québec-Santé (FRQ-S). Este trabajo fue financiado por los institutos canadienses de salud investigación (concesión número CIHR, RP-286437 a M.-É. Huot).
Materials
| DMEM | wisent | 319-005-CL | |
| Trypsine | wisent | 325-043 EL | |
| FBS | Thermo Fisher Scientific | 12483020 | |
| Puroycin antibody 12D10 | EMD millipore | MABE343 | western blot dilution 1:25000 Immunofluoresence dilution 1:10000 |
| Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody | cell signaling technology | 7076 | western blot dilution 1:8000 |
| Western Lightning Plus-ECL | Perkin Elmer | NEL104001EA | |
| Anti-mouse IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor 488 Conjugate) | cell signaling technology | 4408 | immunofluoresecence dilution 1:400 |
| CF568 Phalloidin | biotium | 00044 | immunofluoresecence dilution 1:400 |
| Cyclohexmide | Sigma | C1988-1G | 50µg/ml final concentration |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | final concentration 1µg/ml |
| Puromycin | bio-Basic | PJ593 | 2.5µg/ml to 10µg/ml |
| Ibidi µ-Dish 35 mm, high, ibiTreat | Ibidi | 81156 | |
| MRC-5 cells | ATCC | CCL-171 | |
| HeLa cells | ATCC | CCL-2 | |
| Huh-7 cells | from Dr. Mazroui (Université Laval) | ||
| Fv1000 | olympus | confocal imaging system | |
| Fiji software | http://fiji.sc | ||
| PBS (Phosphate BuffeRed Saline) | bio-Basic | PD8117 | |
| Formaldehyde 37% Solution | bio-Basic | C5300-1 | |
| Triton X-100 | bio-Basic | TB0198 | |
| BSA | Fisher Bioreagents | BP9702-100 | |
| Tween20 | Fisher Bioreagents | BP337-500 | |
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