Summary

Imunofluorescência quantitativa a medida Global localizadas Tradução

Published: August 22, 2017
doi:

Summary

Este manuscrito descreve um método para visualizar e quantificar eventos tradução localizada em compartimentos subcellular. A abordagem proposta neste manuscrito requer um sistema básico de imagens confocal e reagentes e é rápido e econômico.

Abstract

Os mecanismos de regulação tradução do mRNA estão envolvidos em diversos processos biológicos, tais como o desenvolvimento de linha germinal, diferenciação celular e organogênese, bem como em várias doenças. Inúmeras publicações têm demonstrado convincentemente que mecanismos específicos firmemente regulam tradução do mRNA. Aumento do interesse na regulação da expressão da proteína induzida em tradução tem levado ao desenvolvimento de novos métodos de estudar e seguir de novo proteína síntese em cellulo. No entanto, a maioria desses métodos é complexa, tornando-os dispendiosos e muitas vezes limitar o número de destinos de mRNA que podem ser estudados. Este manuscrito propõe um método que requer somente reagentes básicos e um sistema de imagens de fluorescência confocal para medir e visualizar as alterações na tradução de mRNA que ocorrem em qualquer linha de celular em diversas condições. Este método foi usado recentemente mostrar tradução localizada nas estruturas subcelulares de células aderentes durante um curto período de tempo, oferecendo assim a possibilidade de visualizar a tradução de novo por um curto período durante uma variedade de biológicas processos ou de Validando alterações na atividade translacional em resposta a estímulos específicos.

Introduction

O Regulamento de tradução por diferentes funções celulares levou muitas equipes de investigação para desenvolver novas ferramentas e métodos para determinar a Localização subcellular da tradução do mRNA e proteína regulamentado síntese1,2 ,3,4. Estes recentes avanços tecnológicos permitem uma melhor compreensão dos mecanismos que envolvem a tradução upregulation ou a repressão de mRNAs específicos durante processos biológicos, tais como o desenvolvimento neuronal, a resposta de drogas e metástase5 ,6,7,8. No entanto, a maioria desses métodos requerem equipamentos específicos que podem não estar disponíveis para a maioria dos laboratórios e reagentes caros ou perigosos. Como tal, um método de baixo custo para permitir a rápida avaliação de eventos de tradução foi desenvolvido para especificamente contornar esses problemas potenciais. Este método detecta modulações translacionais agudas que ocorrem durante os processos celulares específicos e também permite a localização de tradução usando microscopia confocal.

Os métodos descritos aqui foram usados para monitorar uma tradução localizada dentro de compartimentos subcellular chamado espalhamento iniciação centros (SIC)5. SICs são transitórias estruturas encontradas nas células semeadas que são localizadas no topo de complexos de adesão nascente. Embora SICs e complexos de adesão são distintos, seus destinos estão intimamente ligados. Com efeito, SICs são conhecidos por desaparecer gradualmente após maturação complexo de adesão focal em um site de adesão durante a fase inicial de adesão. Descobrimos que RNA-proteínas conhecidas para controlar especificamente tradução mRNA (por exemplo, Sam68, FMRP e G3BP1) e polyadenylated RNAs foram enriquecidos dentro estas estruturas5. Usando os métodos descritos aqui, nós mostramos que o Regulamento de SIC-associada mRNA tradução age como uma barreira, permitindo semeado células para consolidar a adesão celular. Este método, baseado na incorporação de puromicina, poderia ser considerado uma versão adaptada da superfície de sensoriamento de tradução do ensaio (pôr do sol). Originalmente desenvolvido para medir as taxas de síntese de proteína global usando um aminoácido não-radioativa etiquetado, proteína puromycilation oferece uma maneira eficiente de Visualizar de síntese de proteínas de novo 9. Esse método depende o comportamento intrínseco de puromicina, um antibiótico que bloqueia a tradução por meio de encerramento prematuro da cadeia no Ribossoma10. Com efeito, a puromicina é estruturalmente análoga ao tRNA-correntes, que permite a incorporação alongando cadeias peptídicas através da formação de uma ligação peptídica. No entanto, vinculação de puromicina para uma crescente cadeia peptídica impede que uma nova ligação peptídica sendo formado com o próximo aminoacil-tRNA, desde puromicina tem uma ligação Amida não hidrolisável em vez da ligação éster hidrolisável encontrada em tRNAs. Assim, a incorporação de puromicina alongando polipeptídeos resulta na liberação prematura de numerosos polipeptídeos de puromycilated truncado correspondente ativamente traduzido do mRNA9,11,12 .

Usando este método, foi possível avaliar tradução ativa dentro de uma viúva de curto período de tempo (por exemplo, 5 min) durante a adesão celular usando um anticorpo específico dirigido contra puromicina em células que foram suplementados com o antibiótico para períodos de 5-min em pontos de tempo diferentes durante a adesão célula processo5. A precisão deste teste depende altamente específicos anticorpos dirigidos contra a fracção puromycilated. Detecção de imunofluorescência do polypeptide puromycilated fornece uma repartição geral subcellular do mRNA recentemente traduzidas, que também pode ser quantificada com grande precisão usando sistemas de imagiologia confocal.

Portanto, esse método oferece uma opção relevante para um grande número de laboratórios estudando mecanismos de regulação traducional envolvidos em processos como granulação neuronal6,13,14, 15, morphogen mRNA de localização e tradução durante desenvolvimento16,17. Também é adequado para estudar tradução localizada ou compartimentada durante rápidas eventos biológicos, tais como a migração celular, adesão ou invasão, ou simplesmente avaliar tratamentos com drogas que podem induzir alterações translacional5, 7 , 18. em geral, esse método permite que para a visualização de eventos tradução localizadas ou controlada de uma forma rápida, precisa e econômica.

Protocol

1. determinação das condições de Puromycilation Nota: esta técnica descreve o método usado para avaliar a tradução localizada durante o MRC-5 célula adesão processo 5. Como puromycilation pode ser feito em qualquer célula, é importante otimizar as condições de puromycilation para as linhas de célula específica a ser usado, porque as condições de tratamento não são idênticas para cada linha de celular em termos de concentração de puromicina e o de…

Representative Results

Para observar com precisão eventos de tradução usando a incorporação de puromicina, é fundamental para determinar as condições ideais para cada linha de celular porque cada mostra diferentes puromicina incorporação cinética (Figura 1)9,11 ,12,18. Portanto, para validar a incorporação de puromicina, é necessário trata…

Discussion

Avanços tecnológicos recentes permitiram uma melhor compreensão dos mecanismos envolvidos na regulação alta translacional ou a repressão de mRNAs específicos em processos biológicos, tais como o desenvolvimento neuronal, a resposta de drogas e metástase. A metodologia econômica descrita aqui permite que eventos de tradução ser visualizado em células para estudar como RNA-proteínas regulam processos metastáticos, como adesão celular, migração e invasão.

Apesar de inúmeros m?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos o Dr. Rachid Mazroui (Université Laval, Quebec, Canadá) para a leitura crítica do manuscrito. Agradecemos a célula Imaging unidade do centro de pesquisa para sua assistência técnica. M.-é Huot é um estudioso de pesquisa Junior 1 do de Fonds Recherche du Québec-Santé (FRQ-S). Este trabalho foi apoiado pelo canadense institutos de pesquisa em saúde (número CIHR, MOP-286437 de M.-nao de concessão. Huot).

Materials

DMEM wisent 319-005-CL
Trypsine wisent 325-043 EL
FBS Thermo Fisher Scientific 12483020
Puroycin antibody 12D10 EMD millipore MABE343 western blot dilution 1:25000
Immunofluoresence dilution 1:10000
Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody cell signaling technology 7076 western blot dilution 1:8000
Western Lightning Plus-ECL Perkin Elmer NEL104001EA
Anti-mouse IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor 488 Conjugate) cell signaling technology 4408 immunofluoresecence dilution 1:400
CF568 Phalloidin biotium 00044 immunofluoresecence dilution 1:400
Cyclohexmide Sigma C1988-1G 50µg/ml final concentration
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) Invitrogen D1306 final concentration 1µg/ml
Puromycin bio-Basic PJ593 2.5µg/ml to 10µg/ml
Ibidi µ-Dish 35 mm, high, ibiTreat Ibidi 81156
MRC-5 cells ATCC CCL-171
HeLa cells ATCC CCL-2
Huh-7 cells from Dr. Mazroui (Université Laval)
Fv1000 olympus confocal imaging system
Fiji software http://fiji.sc
PBS (Phosphate BuffeRed Saline) bio-Basic PD8117
Formaldehyde 37% Solution bio-Basic C5300-1
Triton X-100 bio-Basic TB0198
BSA Fisher Bioreagents BP9702-100
Tween20 Fisher Bioreagents BP337-500

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Cite This Article
Bergeman, J., Huot, M. Quantitative Immunofluorescence to Measure Global Localized Translation. J. Vis. Exp. (126), e55909, doi:10.3791/55909 (2017).

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