真菌细胞的活细胞成像研究抗真菌植物防御的进入和亚单位定位
Summary
植物防御在植物防御病原体中起着重要的作用。为了有效地使用这些抗真菌肽作为抗真菌剂, 了解其作用方式 (MOA) 是至关重要的。在这里, 描述了一个活细胞成像方法, 以研究这些肽的 MOA 的关键方面。
Abstract
小的半胱氨酸丰富的防御是在所有植物中存在的最大的寄主防御肽群之一。许多植物防御展示了强有力的在体外抗真菌活性的 broad-spectrum 霉菌病原体, 因此有潜力被用作抗真菌剂在转基因作物。为了充分发挥植物防御对疾病控制的潜力, 阐明其作用机制是至关重要的。随着先进的显微技术的问世, 活细胞成像已经成为了解植物防御抗真菌的动力学的有力工具。在这里, 用两个荧光标记植物防御 (MtDef4 和 MtDef5) 结合生命荧光染料描述了一种基于共聚焦显微镜的活体细胞成像方法。这一技术使 real-time 可视化和分析的动态事件的 MtDef4 和 MtDef5 内化为真菌细胞。重要的是, 这种分析产生了丰富的信息, 包括内化动力学, 进入方式和亚细胞定位这些肽。这些方法与其他细胞生物工具一起, 为这些肽的动态和复杂性提供了重要的洞察力。这些工具也可以用来比较这些肽对不同真菌的 MOA。
Introduction
植物进化了一个复杂的先天免疫系统, 以抵御微生物植物病原体1。他们表达了许多基因编码的宿主防御肽与假定的抗菌活性2。事实上, 这些肽中的许多都是在体外3中显示抗菌活性的。防御包括植物王国中最大的寄主防御肽组之一4。这些富含半胱氨酸的阳离子肽在 micromolar 浓度下表现出对真菌和卵病原体的有效生长抑制作用, 并且是抵御这些病原体的第一条防线5,6。由于其强大的抗真菌活性, 防御可以被利用在 agribiotechnological 的应用, 以产生抗病作物。几种植物防御的本构表达提高了温室的抗病性和转基因作物的田间试验6。重要的是要解开这些抗真菌肽的作用机制 (MOA), 以便充分利用其潜力作为有效的作物保护工具。然而, 对这些植物防御的 MOA 了解得很差。目前的证据表明, 他们表现出不同的 MOA5,6,7,8。一些防御行为 extracellularly 真菌和靶向特定细胞壁/细胞膜驻留鞘, 扰乱膜完整性和激活细胞毒性通路9,10,11。最近, 然而, 抗真菌防御, 转移到真菌细胞已被发现12,13,14。这些防御结合到膜驻留生物活性磷脂, 形成聚复合物和 permeabilize 等离子膜15,16,17。从而阐明了植物防御的某些方面。然而, 植物防御的 MOA 可能涉及一系列复杂的事件, 它们尚未被识别并集成到一个综合模型中。特别是, 在我们对这些肽的细胞靶点的理解上仍然存在很大的差距。
近年来, 随着显微镜技术的发展和新的荧光探针的开发, 活体细胞成像技术已被广泛应用于抗菌肽 (安培) 的研究。这些技术补充了广泛使用的方法, 如 immunolocalization, 电子显微镜, 原子力显微镜或 X 射线断层摄影术18, 主要用于分析抗真菌肽对形态学的影响和真菌细胞的生长, 包括细胞壁完整性的研究, 细胞生长/分支模式的改变, 以及血浆膜性和杀戮。然而, 这些研究仅限于在治疗后的某个时间点的影像细胞, 而不是在同一个细胞上进行延时成像, 以监测它们对防御挑战的动态变化。近年来, 使用荧光标记多肽与活细胞成像结合使用共焦显微镜, 使 real-time 可视化动力学的 AMP–microbe 相互作用。天然纯化和化学合成的抗真菌肽可以标记为荧光标签 (如, DyLight, 罗丹明, BODIPY, 或 Alexa 的染料), 并直接观察在他们与细胞的互动时, 延时活细胞成像。这些标记多肽的使用大大增加了我们对其 MOA 的不同方面的理解, 包括进入模式、亚细胞定位、胞内贩运以及活真菌细胞中的抗真菌作用部位18。
最近, 有几项研究表明, 包括植物防御在内的各种抗真菌肽都是由活真菌细胞内化的12,14,19,20。这些防御的 MOA 可能涉及与细胞内目标的相互作用。我们最近报告了植物防御 MtDef4 在两个囊真菌的抗真菌作用,孢菌和镰刀菌菌。MtDef4 被证明使用不同的途径真菌细胞进入和亚细胞定位这些真菌14。本研究采用化学合成的四甲基罗丹明 (TAMRA) 标记 MtDef4 与生命荧光染料 (膜选择染料, FM4-64; 膜 permeant 染料, SYTOX 绿色; 细胞死亡记者染料, 碘碘化物) 和代谢抑制剂。这些分析显示了 MtDef4 内化的动力学, 其胞内转运机制和亚细胞靶向14。
本文提出了一种利用共焦显微镜进行活细胞成像的协议。该协议利用荧光标记多肽与生命荧光染料结合, 研究植物防御真菌相互作用, 特别是真菌细胞的易位途径和胞内防御的细胞靶点。
Protocol
Representative Results
Discussion
在这项研究中, 一个可靠的活细胞成像方法, 使用荧光标记的抗真菌防御被描述为研究的动力学, 这些肽内化的真菌细胞和确定其亚型靶点。这种方法是一个强大的工具, 以可视化的动态的互动之间的防御和真菌细胞的时空。
采用多种方法研究了真菌细胞内植物防御的内部化和细胞定位。在这些方法中, 防御处理的细胞通常是固定的, 然后处理的 immunolocalization, 电子显微镜, 或 X …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢 Dr. r. 伯格, 在唐纳德丹佛斯植物科学中心的综合显微镜设施主任, 为他的指导和帮助与共焦显微镜。作者没有利益冲突的声明。
Materials
| FM4-64 Dye | Life Technologies | T13320 | |
| DyLight 550 Antibody Labeling Kit | Thermo Scientific | 84530 | |
| Glass Bottom Microwell Dishes | Mat TeK | P35G-1.5-10-C | |
| Mira cloth | EMD Millipore Corp | 475855-1R | |
| SP8-X confocal microscope | Leica | ||
| ImageJ software | FiJi | For Image analysis | |
| Imaris software | Bitplane | For Image analysis |
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