הדמיה לחיות תאים תאים פטרייתי לחקור מצבים של ערך ולוקליזציה Subcellular של הצמח נגד פטריות Defensins
Summary
צמח defensins לשחק תפקיד חשוב בהגנה צמח נגד פתוגנים. עבור שימוש יעיל של אלה פפטידים נגד פטריות כמו סוכני פטריות, הבנת את מצבי הפעולה (מואה) היא קריטית. . הנה, שיטת הדמיה לחיות תאים מתואר ללמוד היבטים קריטיים מואה של פפטידים אלה.
Abstract
Defensins ציסטאין-עשיר קטנים הם אחת הקבוצות הגדולות של פפטידים ההגנה מארח נוכח כל הצמחים. Defensins הצמח רבים שהפגינו חזק במבחנה פטריות פעילות נגד רחבת ספקטרום של פתוגנים ופטריות, ולכן יש פוטנציאל לשמש סוכני פטריות מערכת העברה. על מנת לרתום את מלוא הפוטנציאל של הצמח defensins לבקרת מחלות, חשוב להבהיר שלהם מנגנון פעולה (מואה). עם כניסתו של טכניקות מתקדמות במיקרוסקופ, הדמיה לחיות תאים הפך להיות כלי רב עוצמה להבנת הדינמיקה של מואה פטרת של הצמח defensins. כאן, שיטת הדמיה של תאים חיים מבוסס מיקרוסקופיה קונפוקלית מתואר באמצעות שני defensins צמח שכותרתו fluorescently (MtDef4 ו- MtDef5) בשילוב עם צבעי פלורסנט חיוני. טכניקה זו מאפשרת הדמיה בזמן אמת וניתוח של האירועים הדינאמי של הפנמה MtDef4 ו- MtDef5 לתוך תאים פטרייתי. חשוב, וזמינותו זו יוצרת שפע של מידע, כולל הפנמה קינטיקה, מצב של ערך ולוקליזציה subcellular של פפטידים אלה. בשילוב עם כלים אחרים תא ביולוגי, שיטות אלה סיפקו תובנות קריטי הדינמיקה ואת המורכבות של מואה של פפטידים אלה. כלים אלה יכולים לשמש גם כדי להשוות מואה של פפטידים אלה נגד פטריות שונים.
Introduction
הצמחים התפתחו מערכת חיסונית מולדת מתוחכמים להגנה נגד פתוגנים צמח חיידקים1. הם מבטאים רבים פפטידים ההגנה מארח גן מקודד עם פעילות מיקרוביאלית בשם2. ואכן, רבים של פפטידים אלה מציגים פעילות מיקרוביאלית במבחנה3. Defensins מהווים את אחת הקבוצות הגדולות של פפטידים ההגנה מארח הממלכה של הצמח4. אלה פפטידים עשיר ציסטאין, cationic להפגין פעילות מעכבות צמיחה חזקה נגד פטרייתי, פתוגנים oomycete ריכוזי micromolar, ייצגו אחת השורות הראשונות של הגנה מפני פתוגנים אלה,5,6. בשל פעילותם נגד פטריות חזק, אפשר לנצל defensins ביישומים agribiotechnological ליצירת גידולים עמידים בפני מחלות. ביטוי המכונן של מספר defensins הצמח הוכח כדי לשפר את ההתנגדות המחלה בבדיקות החממה ושדה של העברה6. חשוב לפענח את מנגנוני הפעולה (מואה) של פפטידים פטריות אלה על מנת מלא לרתום את הפוטנציאל שלהם ככלים יעילים עבור הגנת הצומח. עם זאת, מואה של אלה defensins צמח הם הבינו כהלכה. הראיות הנוכחי עולה כי הם מציגים שונות מואה5,6,7,8. כמה defensins לפעול extracellularly פטריות לכוון דופן התא הספציפי/פלזמה ממברנה sphingolipids תושב, לשבש הקרומיות, להפעיל רעילות הסלולר מסלולים9,10,11. לאחרונה, עם זאת, defensins פטריות זה translocate לתוך תאים פטרייתי היה שהתגלו12,13,14. חלק defensins אלה לאגד תושב קרום phospholipids ביו, יוצרים קומפלקסים oligomeric, permeabilize ממברנות פלזמה15,16,17. לפיכך, היבטים מסוימים של מואה של הצמח defensins יש כבר מבואר. עם זאת, מואה של הצמח defensins סביר כוללות מערך מורכב של אירועים אשר עדיין לא מזוהה, משולב לתוך מודל מקיף. בפרט, נותר פער רציני בהבנה שלנו של המטרות הסלולר של פפטידים אלה.
עם ההתקדמות מיקרוסקופ טכנולוגיות ופיתוח של הגששים פלורסנט חדש, טכניקות הדמיה לחיות תאים עכשיו משמשים לעתים קרובות כדי ללמוד מואה של פפטידים מיקרוביאלית (אמפר). טכניקות אלה משלימים שיטות שימוש נרחב כגון immunolocalization, מיקרוסקופ אלקטרונים, מיקרוסקופ כוח אטומי או רנטגן טומוגרפיה18, אשר יש כבר מועסקים בעיקר כדי לנתח את ההשפעות של פפטידים פטריות על המורפולוגיה, הצמיחה של תאים פטרייתי כולל המחקר של דופן התא שלמות, שינוי דפוסי צמיחה/מסעף תא, כמו גם קרום פלזמה permeabilization ולהרוג. למרות זאת, מחקרים אלה היה מוגבל הדמיה תאים בשלב זמן מסוים לאחר הטיפול עם פפטידים במקום ביצוע זמן לשגות הדמיה על אותם התאים כדי לעקוב אחר שינויים דינמיים שלהם בתגובה defensin אתגר. בשנים האחרונות השימוש פפטידים fluorescently שכותרתו בשיתוף עם חיים תא הדמיה באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית אפשרה ויזואליזציה בזמן אמת של הדינמיקה של המגבר – חיידק אינטראקציות. שניהם באופן טבעי טהור ו מסונתז כימית פפטידים פטריות יכול להיות מתויג עם תוויות פלורסנט (למשל, DyLight, rhodamine, BODIPY או אלקסה עבור חיל הים על בסיס צבע), ישירות ציין במהלך האינטראקציה שלהם עם תאים על-ידי בצילום מואץ הדמיה לחיות תאים. השימוש אלה שכותרתו פפטידים גדל באופן משמעותי את ההבנה שלנו של היבטים שונים של שלהם מואה כולל מצב של ערך, לוקליזציה subcellular, וגדילת ואתרים של פעולה נגד פטריות בתוך תאים חיים פטרייתי 18.
לאחרונה, מספר מחקרים הראו כי פפטידים פטריות שונות כולל צמח defensins הם לנחלתו של חיים תאים פטרייתי12,14,19,20. מואה של אלה defensins סביר כרוכות באינטראקציה עם מטרות תאיים. לאחרונה דיווחנו בפעולה נגד פטריות של צמח defensin MtDef4 שני בפטרייה ascomycete, Neurospora crassa , Fusarium graminearum. MtDef4 הוצגה לשימוש מסלולים שונים עבור ערך התא פטרייתי ולוקליזציה subcellular אלה פטריות14. במחקר זה נעשה שימוש כימי מסונתז tetramethyl rhodamine (טמרה)-הנקרא MtDef4 בשילוב עם צבעי פלורסנט חיוני (קרום בררני לצבוע, FM4-64; צבע ממברנה-permeant, SYTOX ירוק תא מותו כתב לצבוע, יודיד propidium), מעכבי חילוף החומרים. ניתוחים אלה הפגינו את קינטיקה של ההפנמה של MtDef4, שלה מנגנונים תאיים תחבורה שלו מטרות subcellular14.
כאן מוצג עבור הדמיה לחיות תאים באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית פרוטוקול. הפרוטוקול מנצל פפטידים שכותרתו fluorescently בשילוב עם צבעי פלורסנט חיוני ללמוד אינטראקציות צמח defensin-פטרייתי, בפרט, המסלולים של טרנסלוקציה המטרות תאיים של defensins בתאים פטרייתי.
Protocol
Representative Results
Discussion
במחקר זה, מתודולוגיה אמינה של הדמיה לחיות תאים עם השימוש fluorescently שכותרתו defensins פטריות שתואר ללמוד את קינטיקה של ההפנמה של פפטידים אלה לתוך תאים פטרייתי וכדי לקבוע את המטרות subcellular. שיטה זו היא כלי רב עוצמה כדי להמחיש את הדינמיקה של האינטראקציה בין defensins ותאים פטרייתי חנותם והמרגשים.
<p class="…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים ד ר ר הווארד ברג, מנהל מתקן מיקרוסקופ משולבת במרכז דונלד Danforth צמח המדע, להדרכה שלו ולעזור עם מיקרוסקופיה קונפוקלית. המחברים יש אין ניגוד אינטרסים להכריז.
Materials
| FM4-64 Dye | Life Technologies | T13320 | |
| DyLight 550 Antibody Labeling Kit | Thermo Scientific | 84530 | |
| Glass Bottom Microwell Dishes | Mat TeK | P35G-1.5-10-C | |
| Mira cloth | EMD Millipore Corp | 475855-1R | |
| SP8-X confocal microscope | Leica | ||
| ImageJ software | FiJi | For Image analysis | |
| Imaris software | Bitplane | For Image analysis |
References
- Jones, J. D. G., Dangl, J. L. The plant immune system. Nature. 444 (7117), 323-329 (2006).
- Tavormina, P., De Coninck, B., Nikonorova, N., De Smet, I., Cammue, B. P. A. The Plant Peptidome: An expanding repertoire of structural features and biological functions. Plant cell. 27 (8), 2095-2118 (2015).
- Van Der Weerden, N. L., Bleackley, M. R., Anderson, M. A. Properties and mechanisms of action of naturally occurring antifungal peptides. Cell. and Mol. Life Sci. 70 (19), 3545-3570 (2013).
- Van der Weerden, N. L., Anderson, M. A. Plant defensins: Common fold, multiple functions. Fungal Biol Rev. 26 (4), 121-131 (2013).
- De Coninck, B., Cammue, B. P. A., Thevissen, K. Modes of antifungal action and in planta functions of plant defensins and defensin-like peptides. Fungal Biol Rev. 26 (4), 109-120 (2013).
- Kaur, J., Sagaram, U. S., Shah, D. Can plant defensins be used to engineer durable commercially useful fungal resistance in crop plants?. Fungal Biol. Rev. 25 (3), 128-135 (2011).
- Vriens, K., Cammue, B. P. A., Thevissen, K. Antifungal plant defensins: Mechanisms of action and production. Molecules. 19 (8), 12280-12303 (2014).
- Sagaram, U. S., Kaur, J., Shah, D. Antifungal plant defensins: Structure-activity relationships, modes of action, and biotech applications. ACS Symp. Ser. 1095, 317-336 (2012).
- Thevissen, K., Francois, I. E. J. A., Aerts, A. M., Cammue, B. P. A. Fungal sphingolipids as targets for the development of selective antifungal therapeutics. Curr. Drug Targets. 6 (8), 923-928 (2005).
- Thevissen, K., Kristensen, H. H., Thomma, B. P. H. J., Cammue, B. P. A., Francois, I. E. J. A. Therapeutic potential of antifungal plant and insect defensins. Drug Discov. Today. 12 (21-22), 966-971 (2007).
- Aerts, A. M., François, I. E. J. A., Cammue, B. P. A., Thevissen, K. The mode of antifungal action of plant, insect and human defensins. Cell. Mol. Life Sci. 65 (13), 2069-2079 (2008).
- Van Der Weerden, N. L., Lay, F. T., Anderson, M. A. The plant defensin, NaD1, enters the cytoplasm of Fusarium oxysporum hyphae. J. Biol. Chem. 283 (21), 14445-14452 (2008).
- Lobo, D. S., Pereira, I. B., et al. Antifungal Pisum sativum Defensin 1 Interacts with Neurospora crassa Cyclin F Related to the Cell Cycle. 생화학. 46 (4), 987-996 (2007).
- El-Mounadi, K., Islam, K. T., Hernandez-Ortiz, P., Read, N. D., Shah, D. M. Antifungal mechanisms of a plant defensin MtDef4 are not conserved between the ascomycete fungi Neurospora crassa and Fusarium graminearum. Mol. Microbiol. 100 (3), 542-559 (2016).
- Baxter, A. A., et al. The Tomato Defensin TPP3 Binds Phosphatidylinositol (4,5)-Bisphosphate via a Conserved Dimeric Cationic Grip Conformation To Mediate Cell Lysis. Mol. and Cell. Biol. 35 (11), 1964-1978 (2015).
- Kvansakul, M., et al. Binding of phosphatidic acid by NsD7 mediates the formation of helical defensin-lipid oligomeric assemblies and membrane permeabilization. Proc. Natl. Acad. Sci. 113, 11202-11207 (2016).
- Poon, I. K. H., et al. Phosphoinositide-mediated oligomerization of a defensin induces cell lysis. eLife. 3, e01808 (2014).
- Muñoz, A., Read, N. D. Live-cell imaging and analysis shed light on the complexity and dynamics of antimicrobial Peptide action. Front. Immunol. 3, 248 (2012).
- Hayes, B. M. E., et al. Identification and mechanism of action of the plant defensin NaD1 as a new member of the antifungal drug arsenal against candida albicans. Antimicrob. Agents Chemother. 57 (8), 3667-3675 (2013).
- Muñoz, A., Marcos, J. F., Read, N. D. Concentration-dependent mechanisms of cell penetration and killing by the de novo designed antifungal hexapeptide PAF26. Mol. Microbiol. 85 (1), 89-106 (2012).
- Eaton, C. J., et al. The guanine nucleotide exchange factor RIC8 regulates conidial germination through Gα proteins in Neurospora crassa. PLoS One. 7 (10), e48026 (2012).
- Leslie, J. F., Summerell, B. A. . The Fusarium. laboratory manual. , (2006).
- Broekaert, W. F., Terras, F. R. G., Cammue, B. P. A., Vanderleyden, J. An automated quantitative assay for fungal growth inhibition. FEMS Microbiol.Lett. 69 (1-2), 55-59 (1990).
- Sagaram, U. S., et al. Structural and functional studies of a phosphatidic acid-binding antifungal plant defensin MtDef4: Identification of an RGFRRR motif governing fungal cell entry. PLoS One. 8 (12), 1-22 (2013).
- Uchida, M., et al. Soft X-ray tomography of phenotypic switching and the cellular response to antifungal peptoids in Candida albicans. Proc. Natl. Acad. Sci. 106 (46), 19375-19380 (2009).
- Nair, R., et al. Better prediction of sub-cellular localization by combining evolutionary and structural information. Proteins Struct. Funct. Bioinform. 53 (4), 917-930 (2003).
- Scott, M. S., Calafell, S. J., Thomas, D. Y., Hallett, M. T. Refining protein subcellular localization. PLoS Comput. Biol. 1 (6), e66 (2005).
- Shagaghi, N., Bhave, M., Palombo, E., Clayton, A. Revealing the sequence of interactions of PuroA peptide with Candida albicans cells by live-cell imaging. Sci. Rep. 7, 43542 (2017).
