Imágenes de células vivas de células fúngicas a investigar los modos de entrada y localización subcelular de defensinas de plantas antifúngicas
Summary
Planta defensinas juegan un papel importante en defensa de la planta contra patógenos. Para el uso efectivo de estos péptidos antifúngicos como antifúngicos, comprender sus modos de acción (MOA) es crítico. Aquí, se describe un método de proyección de imagen de células vivas para estudiar los aspectos críticos de MOA de estos péptidos.
Abstract
Pequeños ricos en cisteína defensinas son uno de los mayores grupos de péptidos de defensa anfitrión presentes en todas las plantas. Muchos defensinas de plantas exhiben potentes en vitro la actividad antifúngica contra un amplio espectro de hongos patógenos y por lo tanto tienen el potencial para ser utilizados como agentes antifúngicos en cultivos transgénicos. Con el fin de aprovechar todo el potencial de defensinas de plantas para el control de enfermedades, es crucial dilucidar sus mecanismos de acción (MOA). Con el advenimiento de las técnicas de microscopía avanzada, proyección de imagen de células vivas se ha convertido en una poderosa herramienta para la comprensión de la dinámica de la MOA antihongos de defensinas de plantas. Aquí, se describe un método de imagen de microscopía confocal en células vivas usando dos planta fluorescente etiquetado defensinas (MtDef4 y MtDef5) en combinación con colorantes fluorescentes vitales. Esta técnica permite la visualización en tiempo real y análisis de los eventos dinámicos de la imputación de MtDef4 y MtDef5 en células fúngicas. Lo importante, esta prueba genera una riqueza de información, incluyendo la cinética de la internalización, modo de entrada y localización subcelular de estos péptidos. Junto con otras herramientas biológicas de la célula, estos métodos han proporcionado penetraciones importantes en la dinámica y complejidad de MOA de estos péptidos. Estas herramientas también pueden utilizarse para comparar el MOA de estos péptidos contra diversos hongos.
Introduction
Las plantas han desarrollado un sofisticado sistema inmune innato para la defensa contra patógeno microbiana planta1. Que expresan numerosos péptidos de defensa del anfitrión codificada por el gen con supuesta actividad antimicrobiana2. De hecho, muchos de estos péptidos muestran actividad antimicrobiana en vitro3. Defensinas constituyen uno de los mayores grupos de péptidos de defensa del huésped en el Reino de planta4. Estos péptidos ricos en cisteína, catiónicos presentan actividad inhibitoria del crecimiento potente contra hongos y oomicetos patógenos en la concentraciones micromolar y representan una de las primeras líneas de defensa contra estos agentes patógenos5,6. Debido a su potente actividad antifúngica, defensinas pueden explotarse en aplicaciones agribiotechnological para generar cultivos resistentes a la enfermedad. Sobre-expresión constitutiva de varios defensinas de plantas se ha demostrado para mejorar la resistencia a enfermedades en las pruebas de invernadero y campo de cultivos transgénicos6. Es importante desentrañar los mecanismos de acción (MOA) de estos péptidos antifúngicos para aprovechar plenamente su potencial como herramientas eficaces para la protección de cultivos. Sin embargo, el MOA de estas defensinas de plantas es poco conocido. La evidencia actual sugiere que exhiben diferentes MOA5,6,7,8. Algunas defensinas actúan extracelularmente sobre hongos objetivo específico plasma pared celular membrana residente esfingolípidos, alteran la integridad de la membrana y activan vías de toxicidad celular9,10,11. Recientemente, sin embargo, defensinas antihongos que translocan en células fúngicas han sido descubiertos12,13,14. Algunas de estas defensinas se unen a fosfolípidos bioactivos reside en la membrana, forman complejos oligoméricos y permeabilizar las membranas de plasma15,16,17. Así, se han aclarado algunos aspectos de la MOA de defensinas de plantas. Sin embargo, el MOA de defensinas de plantas probablemente implica una compleja serie de eventos que aún no han sido identificados e integrado en un modelo integral. En particular, queda un gran vacío en nuestro conocimiento de las dianas celulares de estos péptidos.
Con los avances recientes en tecnologías de la microscopia y el desarrollo de nuevas sondas fluorescentes, técnicas de imagen de células vivas ahora utilizan con frecuencia para estudiar el MOA de péptidos antimicrobianos (AMPs). Estas técnicas complementan ampliamente utilizados métodos como la inmunolocalización, microscopia electrónica, microscopía de fuerza atómica o de tomografía de rayos x18, que se emplean sobre todo para analizar los efectos de los péptidos antifúngicos en la morfología y crecimiento de las células fúngicas incluyendo el estudio de la integridad de la pared celular, alteraciones en los patrones de crecimiento/ramificación de celdas, así como la permeabilización de la membrana plasmática y matando. Sin embargo, estos estudios se han limitado a las células en un cierto momento la proyección de imagen después del tratamiento con los péptidos en lugar de realizar la proyección de imagen en las células del mismo para monitorear sus cambios dinámicos en respuesta al desafío de Defensina Time-lapse. En los últimos años, uso de fluorescencia etiquetadas péptidos junto con células vivas usando microscopia confocal de imágenes ha permitido una visualización en tiempo real de la dinámica de las interacciones de la AMP – microbio. Ambos naturalmente purificaron y síntesis química de péptidos antifúngicos pueden etiquetados con etiquetas fluorescentes (p. ej., DyLight, rodamina, BODIPY o Alexa Fluor basado en colorantes) y observado directamente durante su interacción con las células de Time-lapse imágenes de células vivas. El uso de estos etiquetados péptidos ha aumentado significativamente nuestra comprensión de los diferentes aspectos de su MOA incluyendo el modo de entrada, localización subcelular, tráfico intracelular y sitios de acción antifúngica dentro de las células vivas de hongos 18.
Recientemente, varios estudios han demostrado que varios péptidos antifúngicos incluyendo planta defensinas se internalizan por vivir células fúngicas12,14,19,20. El MDA de estas defensinas probablemente implica interacción con objetivos intracelulares. Recientemente hemos reportado la acción antifúngica de una planta de Defensina MtDef4 en dos hongos ascomiceto Neurospora crassa y Fusarium graminearum. MtDef4 se demostró que utilizar diferentes vías para la entrada de la célula fúngica y localización subcelular en estos hongos14. Este estudio utilizada químicamente sintetizado tetrametil rodamina (TAMRA)-con la etiqueta MtDef4 en combinación con colorantes fluorescentes vitales (el tinte selectiva de la membrana, FM4-64; colorante florescente de membrana, SYTOX Green y el tinte de reportero de muerte celular, yoduro de propidio) y inhibidores metabólicos. Estos análisis demostraron la cinética de la internalización de la MtDef4, sus mecanismos de transporte intracelular y sus objetivos subcelulares14.
Aquí, se presenta un protocolo para obtener imágenes de células vivas usando microscopia confocal. El protocolo utiliza fluorescencia etiquetadas péptidos en combinación con colorantes vitales fluorescentes para estudiar interacciones Defensina-hongos de la planta, en particular, las vías de desplazamiento y los blancos intracelulares de defensinas en células fúngicas.
Protocol
Representative Results
Discussion
En este estudio, una metodología de proyección de imagen células vivas confiable con el uso de fluorescencia etiquetada antifúngico defensinas fue descrita para el estudio de la cinética de la internalización de estos péptidos en células fúngicas y para determinar sus objetivos subcelulares. Este método es una poderosa herramienta para visualizar la dinámica de la interacción entre las células fúngicas y defensinas, temporal y espacial.
Varios métodos se han utilizado para el es…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Dr. R. Howard Berg, Director de la instalación de microscopía integrado en el centro Donald Danforth planta ciencia, para su orientación y ayuda con microscopía confocal. Los autores no tienen ningún conflicto de intereses.
Materials
| FM4-64 Dye | Life Technologies | T13320 | |
| DyLight 550 Antibody Labeling Kit | Thermo Scientific | 84530 | |
| Glass Bottom Microwell Dishes | Mat TeK | P35G-1.5-10-C | |
| Mira cloth | EMD Millipore Corp | 475855-1R | |
| SP8-X confocal microscope | Leica | ||
| ImageJ software | FiJi | For Image analysis | |
| Imaris software | Bitplane | For Image analysis |
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