عالية متعددة، والتصوير فائقة الدقة من الخلايا T باستخدام مادستورم
Summary
نحن نبرهن على طريقة لصورة الجزيئات متعددة داخل نانو الهياكل غير متجانسة في دقة جزيء واحد باستخدام ملزم متتابعة وشطف من الأجسام المضادة فلورزنتلي المسمى.
Abstract
وقد عرقل التصوير الهياكل الخلوية غير متجانسة باستخدام جزيء واحد المترجمة المجهري من قبل عدم كفاية الدقة التعريب والقدرة على مضاعفة. باستخدام الفلورسنت نانو الماس علامات فيدوسيال، ونحن تصف تصحيح الانجراف وإجراءات المحاذاة المطلوبة للحصول على دقة عالية في جزيء واحد المترجمة المجهري. وبالإضافة إلى ذلك، يتم وصف استراتيجية تعدد الإرسال الجديدة، مادستورم، التي تستهدف جزيئات متعددة في نفس الخلية باستخدام ملتزمة متتابعة وشطف من الأجسام المضادة الفلورسنت. ويظهر مادستورم على خلية T تنشيط لتصور مواقع مكونات مختلفة داخل هيكل غشاء، متعدد البروتينات يسمى مستقبلات الخلايا الدقيقة T. وبالإضافة إلى ذلك، ويناقش تطبيق مادستورم كأداة عامة لتصور الهياكل متعددة البروتين.
Introduction
وقد وضعت مجموعة متنوعة من تقنيات فائقة الدقة المجهر للتغلب على حد حيود المجهر الضوئي (~ 200 نانومتر). من بين هذه هي فئة من التقنيات تسمى جزيء واحد المجهر توطين (سملم) الذي يتضمن الصورة تنشيط التنشيط المجهري (بالم) والموجات الدقيقة المجهر الضوئي العشوائي (ستورم). تقنيات سملم حصة في استخدام فلوروفوريس التي يمكن أن تنتقل بين (على الفلورسنت) وخارج (الظلام / صورة التبديل) الدول، مما يسمح توطين متتابعة من مضان من جزيئات واحدة 1 ، 2 ، 3 .
وبسبب توافقه مع الأصباغ والمجاهر المتاحة تجاريا، أصبح ستورم المباشر (دستورم) تقنية سملم المعتمدة على نطاق واسع 4 . دستورم يمكن أن يحقق بشكل روتيني ~ 10 نانومتر توطين الدقة، وتعرف بأنها عدم اليقين في حساب مركز من الانعكاسأيون محدود نقطة انتشار وظيفة (بسف). ومع ذلك، على الرغم من الدقة العالية المقدرة باستخدام خوارزميات توطين 5 ، 6 ، 7 ، وقد عرقل تحديد دقيق للموقع الفعلي من جزيئات واحدة من قبل عدد من القضايا. أولا، الحركة الميكانيكية للمرحلة المجهر أثناء الحصول على الصور يضيف عدم اليقين كبيرة لدقة التعريب. كما يتم الحصول على الصور سملم أكثر من الآلاف من الأطر الزمنية الفاصل الزمني، والحركات نانو على نطاق والمرحلة المجهر يمكن أن يضر بشكل كبير دقة الصورة النهائية فائقة الدقة 8 . للتعويض عن حركة المرحلة أثناء الحصول على الصور، ويقدر عادة الانجراف المرحلة من الانحدار القائم على تركيب التوطين بيند من الصورة نفسها (عبر الارتباط) أو التعريبات متتابعة من علامات فيدوسيال (تصحيح فيدوسيال) 1 ، 9 . Howevإيه، تتطلب هذه الأساليب التحسين من المعلمات متعددة لكل كومة الصورة، ولا يمكن أن تمثل لحركات المرحلة في جداول زمنية قصيرة مثل الاهتزاز الميكانيكي. وقد استخدمت جسيمات النانو الذهب وحبات الفلورسنت متعددة الألوان كعلامات فيدوسيال في سملم، ولكنها ليست مستقرة الصورة، وتؤدي إلى دقة أقل بكثير بعد تصحيح الانجراف من النيتروجين الشواغر مركز الفلورسنت نانو الماس (فندس) المستخدمة في مادستورم 10 .
بالإضافة إلى الحد من الحيود، والمجهر الضوئي أكثر تقييدا من قبل الحدود الطيفية. التصور في وقت واحد من أهداف متعددة يتطلب تحقيقات الفلورسنت مع التشكيلات الطيفية غير متداخلة، وتقييد عموما مضان الضوء القائم على المجهر إلى 6 ألوان و سملم إلى 2-3 ألوان 4 ، 11 ، 12 . وعلاوة على ذلك، انحراف لوني غير الخطية يسبب عدم اتساق الصور متعددة الألوان، ثهيش تتطلب إجراءات محاذاة واسعة باستخدام علامات متعددة الألوان فيدوسيال 8 ، 13 . للتغلب على هذه الحدود، وقد صورت الدراسات السابقة أهداف متعددة باستخدام فوتوبلاشينغ المتكررة أو التبريد الكيميائي من فلوروفوريس ملزمة بالتتابع 14 ، 15 ، 16 ، 17 ، 18 ، 19 . في حين أن هذه الأساليب يمكن التغلب على الحدود الطيفية للمجهر، ومن المعروف تبييض مضان لتكون عملية سامة 20 ، والتبييض لفترات طويلة أو التبريد قد يسبب آثار جانبية غير مرغوب فيها مثل فقدان التشابك. وعلاوة على ذلك، فإن تراكم تحقيقات الفلورسنت يمكن أن يؤدي إلى حجب ستيريك من مواقع الربط في العينة، ومنع تعدد الإرسال على نطاق واسع واستهداف قوي من الحواتم. ولتجنب مثل هذا التداخل الاستباقي، حدث مؤخراتيودي تحقيق تعدد الإرسال باستخدام تبادل مؤشر ستوكاستيك من شظايا البروتين نشر بحرية 21 . في حين أن هذا الأسلوب يسمح وضع العلامات كثيفة من الهياكل الخلوية، فإنه يتطلب إعداد البيوكيميائية واسعة لعزل شظايا الببتيد، لا يمكن تحديد مواقع جزيء واحد، ولا يسهل بسهولة متعددة النطاق على نطاق واسع باستخدام تحقيقات المتاحة تجاريا. نقدم بروتوكول فيديو مفصل يصف ملزمة متتابعة وشطف من الأجسام المضادة فلوريسنتلي لمضاعفة، والأضداد محدودة الحجم دستورم (مادستورم) التصوير، واستخدام الفلورسنت نانو الماس لتحقيق تصحيح الانجراف الدقيق والمحاذاة.
Protocol
Representative Results
Discussion
وتتيح عمليات تعدد الإرسال المتتابعة، وتصحيح الانحراف، وإجراءات المحاذاة في مادستورم تصورا دقيقا ومتعدد الإرسال للغاية للهياكل غير المتجانسة في الخلايا. 10 بالإضافة إلى ذلك، مادستورم يتجنب القيود من متعدد الألوان ستورم مثل انحراف لوني والخصائص دون الم?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر شوفنغ وو للوصول إلى المجهر ستورم. وقد تم دعم هذا البحث من قبل برنامج البحوث الداخلية للمركز الوطني للسرطان معهد (نسي) لأبحاث السرطان والمعهد الوطني لرئة القلب والدم (نهلبي).
Materials
| 8 well coverslip chamber | Lab-tek | 155409 | |
| 0.1% Poly-L-Lysine solution | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| NV-100nm Fluorescent Nano-diamond | Adamas | Red FND | |
| anti-CD3ε antibody | BD Biosciences | 555329 | |
| Bovine serum albumin, Fraction V | KSE Scientific | 98-100P | |
| Triton-X | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| 10% Paraformaldehyde | EMS | 15712 | Carcinogen |
| Gelatin from fresh water fish skin | Sigma-Aldrich | G7041 | |
| Alexa 647 antibody labeling kit | Thermo Fisher | A20186 | |
| Magnesium Chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | 138924 | |
| PIPES | Sigma-Aldrich | P6757 | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M7154 | Highly toxic, air sensitive |
| Cysteamine | Sigma-Aldrich | 30070 | Highly toxic |
| Cyclooctatetraene 98% | Sigma-Aldrich | 138924 | Highly toxic, air sensitive |
| 10x PBS | KD Medical | RGF-3210 | |
| 10x TBS | KD Medical | RGF-3385 |
References
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Hess, S. T., Girirajan, T. P., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophys J. 91 (11), 4258-4272 (2006).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nat Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
- van de Linde, S., et al. Direct stochastic optical reconstruction microscopy with standard fluorescent probes. Nat Protoc. 6 (7), 991-1009 (2011).
- Mortensen, K. I., Churchman, L. S., Spudich, J. A., Flyvbjerg, H. Optimized localization analysis for single-molecule tracking and super-resolution microscopy. Nat Methods. 7 (5), 377-381 (2010).
- Thompson, R. E., Larson, D. R., Webb, W. W. Precise nanometer localization analysis for individual fluorescent probes. Biophys J. 82 (5), 2775-2783 (2002).
- Rieger, B., Stallinga, S. The lateral and axial localization uncertainty in super-resolution light microscopy. Chemphyschem. 15 (4), 664-670 (2014).
- Pertsinidis, A., Zhang, Y., Chu, S. Subnanometre single-molecule localization, registration and distance measurements. Nature. 466 (7306), 647-651 (2010).
- Bates, M., Jones, S. A., Zhuang, X. Stochastic optical reconstruction microscopy (STORM): a method for superresolution fluorescence imaging. Cold Spring Harb Protoc. (6), 498-520 (2013).
- Yi, J., et al. madSTORM: a superresolution technique for large-scale multiplexing at single-molecule accuracy. Mol Biol Cell. 27 (22), 3591-3600 (2016).
- Bates, M., Huang, B., Dempsey, G. T., Zhuang, X. Multicolor super-resolution imaging with photo-switchable fluorescent probes. Science. 317 (5845), 1749-1753 (2007).
- Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging. Nat Methods. 8 (12), 1027-1036 (2011).
- Erdelyi, M., et al. Correcting chromatic offset in multicolor super-resolution localization microscopy. Opt Express. 21 (9), 10978-10988 (2013).
- Gerdes, M. J., et al. Highly multiplexed single-cell analysis of formalin-fixed, paraffin-embedded cancer tissue. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (29), 11982-11987 (2013).
- Jungmann, R., et al. Multiplexed 3D cellular super-resolution imaging with DNA-PAINT and Exchange-PAINT. Nat Methods. 11 (3), 313-318 (2014).
- Nanguneri, S., Flottmann, B., Horstmann, H., Heilemann, M., Kuner, T. Three-dimensional tomographic super-resolution fluorescence imaging of serially sectioned thick samples. PLoS One. 7 (5), e38098 (2012).
- Schubert, W., et al. Analyzing proteome topology and function by automated multidimensional fluorescence microscopy. Nat Biotechnol. 24 (10), 1270-1278 (2006).
- Tam, J., Cordier, G. A., Borbely, J. S., Sandoval Alvarez, A., Lakadamyali, M. Cross-talk-free multi-color STORM imaging using a single fluorophore. PLoS One. 9 (7), e101772 (2014).
- Valley, C. C., Liu, S., Lidke, D. S., Lidke, K. A. Sequential superresolution imaging of multiple targets using a single fluorophore. PLoS One. 10 (4), e0123941 (2015).
- Hoebe, R. A., et al. Controlled light-exposure microscopy reduces photobleaching and phototoxicity in fluorescence live-cell imaging. Nat Biotechnol. 25 (2), 249-253 (2007).
- Kiuchi, T., Higuchi, M., Takamura, A., Maruoka, M., Watanabe, N. Multitarget super-resolution microscopy with high-density labeling by exchangeable probes. Nat Methods. 12 (8), 743-746 (2015).
- Campi, G., Varma, R., Dustin, M. L. Actin and agonist MHC-peptide complex-dependent T cell receptor microclusters as scaffolds for signaling. J Exp Med. 202 (8), 1031-1036 (2005).
- Sarkar, S. K., et al. Wide-field in vivo background free imaging by selective magnetic modulation of nanodiamond fluorescence. Biomed Opt Express. 5 (4), 1190-1202 (2014).
