Imagem altamente multiplexada e de super resolução de células T usando madSTORM
Summary
Demonstamos um método para imagem de múltiplas moléculas dentro de nanoestruturas heterogêneas com precisão de molécula única usando ligação sequencial e eluição de anticorpos marcados fluorescentemente.
Abstract
A imagem de estruturas celulares heterogêneas usando microscopia de localização de molécula única foi dificultada por precisão de localização inadequada e capacidade de multiplexação. Usando marcadores fiduciários de nano-diamante fluorescentes, descrevemos os procedimentos de correção e alinhamento da deriva necessários para obter alta precisão em microscopia de localização única de moléculas. Além disso, uma nova estratégia de multiplexação, madSTORM, é descrita em que moléculas múltiplas são direcionadas na mesma célula usando ligação seqüencial e eluição de anticorpos fluorescentes. MadSTORM é demonstrado em uma célula T ativada para visualizar as localizações de diferentes componentes dentro de uma estrutura de múltiplas proteínas ligada à membrana chamada de microcluster do receptor de células T. Além disso, a aplicação de madSTORM como uma ferramenta geral para a visualização de estruturas multi-proteínas é discutida.
Introduction
Uma variedade de técnicas de microscopia de super resolução foi desenvolvida para superar o limite de difracção do microscópio de luz (~ 200 nm). Entre estas, uma categoria de técnicas denominada microscopia de localização de moléculas únicas (SMLM), que inclui microscopia de localização foto-ativação (PALM) e microscopia estocástica de reconstrução óptica (STORM). As técnicas SMLM compartilham o uso de fluoróforos que podem ser alternados entre os estados fluorescentes (offs) e off (dark / photo-switched), permitindo a localização sequencial da fluorescência a partir de moléculas únicas 1 , 2 , 3 .
Devido à sua compatibilidade com corantes e microscópios comercialmente disponíveis, o STORM direto (dSTORM) tornou-se uma técnica SMLM amplamente adotada 4 . DSTORM pode normalmente atingir uma precisão de localização de ~ 10 nm, definida como a incerteza no cálculo do centro de uma difraçãoFunção de espalhamento de ponto limitado a iões (PSF). No entanto, apesar da alta precisão estimada usando os algoritmos de localização 5 , 6 , 7 , a determinação precisa da localização real de moléculas únicas foi prejudicada por uma série de problemas. Primeiro, o movimento mecânico do estágio do microscópio durante a aquisição da imagem aumenta a incerteza significativa na precisão da localização. À medida que as imagens SMLM são obtidas através de milhares de quadros de lapso de tempo, os movimentos de nano-escala do estágio do microscópio podem comprometer significativamente a precisão da imagem super-resolução final 8 . Para compensar o movimento do palco durante a aquisição da imagem, a derivação do estágio é geralmente estimada a partir de ajustes baseados em regressão de localizações binadas da própria imagem (correlação cruzada) ou localizações seqüenciais de marcadores fiduciais (correção fiducial) 1 , 9 . HowevEsses métodos requerem a otimização de vários parâmetros para cada pilha de imagens e não podem ser considerados movimentos de estágio em escalas de curta duração, como a vibração mecânica. As nanopartículas de ouro e as esferas fluorescentes multicoloridas foram usadas como marcadores fiduciários no SMLM, mas não são estáveis em fotos e resultam em precisão significativamente menor após a correção da deriva do que os nano-diamantes fluorescentes de centro de vacância de nitrogênio (FNDs) utilizados Em madSTORM 10 .
Além do limite de difracção, o microscópio de luz é ainda restringido por limites espectrais. A visualização simultânea de múltiplos alvos requer sondas fluorescentes com perfis espectrais não sobrepostos, geralmente restringindo o microscópio de luz à base de fluorescência a 6 cores e SMLM a 2-3 cores 4 , 11 , 12 . Além disso, a aberração cromática não linear provoca desalinhamento de imagens multicoloridas, wQue exigem extensos procedimentos de alinhamento usando marcadores fiduciários multicoloridos 8 , 13 . Para superar esses limites, estudos anteriores criaram imagens de múltiplos alvos usando fotobloco repetitivo ou extinção química de fluoróforos 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 . Embora estes métodos possam superar os limites espectrais da microscopia, o branqueamento com fluorescência é conhecido por ser um processo tóxico 20 , e o branqueamento prolongado ou a extinção pode causar efeitos colaterais indesejáveis, como perda de reticulação. Além disso, o acúmulo de sondas fluorescentes poderia levar ao bloqueio estérico de locais de ligação na amostra, evitando a multiplexação em grande escala e a segmentação robusta de epítopos. Para evitar tais interferências estéticas, uma recente sTudy conseguiu a multiplexação usando a troca estocástica de fragmentos de proteínas que difundem livremente 21 . Considerando que este método permite rotulagem densa de estruturas celulares, requer uma preparação bioquímica extensa para isolar fragmentos de péptidos, não pode localizar posições de moléculas únicas e não prontamente facilita a multiplexação em larga escala usando sondas comercialmente disponíveis. Apresentamos um protocolo de vídeo detalhado que descreve a ligação seqüencial e a eluição de anticorpos fluorescentes para imagens multiplexadas, tamanho limitado de anticorpos dSTORM (madSTORM) e uso de nano-diamantes fluorescentes para obter correção e alinhamento preciso da deriva.
Protocol
Representative Results
Discussion
Os procedimentos de multiplexagem seqüencial, correção de deriva e alinhamento em madSTORM permitem uma visualização precisa e altamente multiplexada de estruturas heterogêneas nas células. 10 Além disso, madSTORM evita as limitações de STORM multicolor, como a aberração cromática e as propriedades de troca / troca de fotos sub-ótimas de corantes vermelhos não distantes 9 , 12 . À medida que o passo de eluição reduz sign…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos ao Xufeng Wu o acesso ao microscópio STORM. Esta pesquisa foi apoiada pelo Programa de Pesquisa Intramural do Instituto Nacional do Câncer (NCI) Center for Cancer Research e do National Heart Lung and Blood Institute (NHLBI).
Materials
| 8 well coverslip chamber | Lab-tek | 155409 | |
| 0.1% Poly-L-Lysine solution | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| NV-100nm Fluorescent Nano-diamond | Adamas | Red FND | |
| anti-CD3ε antibody | BD Biosciences | 555329 | |
| Bovine serum albumin, Fraction V | KSE Scientific | 98-100P | |
| Triton-X | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| 10% Paraformaldehyde | EMS | 15712 | Carcinogen |
| Gelatin from fresh water fish skin | Sigma-Aldrich | G7041 | |
| Alexa 647 antibody labeling kit | Thermo Fisher | A20186 | |
| Magnesium Chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | 138924 | |
| PIPES | Sigma-Aldrich | P6757 | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M7154 | Highly toxic, air sensitive |
| Cysteamine | Sigma-Aldrich | 30070 | Highly toxic |
| Cyclooctatetraene 98% | Sigma-Aldrich | 138924 | Highly toxic, air sensitive |
| 10x PBS | KD Medical | RGF-3210 | |
| 10x TBS | KD Medical | RGF-3385 |
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