Molto multiplo, la risoluzione super-risoluzione delle celle T utilizzando la madSTORM
Summary
Abbiamo dimostrato un metodo per l'immagine di molteplici molecole all'interno di nano-strutture eterogenee alla precisione di una singola molecola utilizzando il legame sequenziale e l'eluzione di anticorpi a fluorescenza.
Abstract
Imaging di strutture cellulari eterogenee utilizzando la microscopia di localizzazione a singola molecola è stata ostacolata da inadeguate capacità di localizzazione e di multiplexing. Utilizzando marcatori fiduciari a fluorescenza nano-diamante, descriviamo le procedure di correzione e di allineamento necessarie per ottenere un'elevata precisione nella microscopia di localizzazione singola molecola. Inoltre, viene descritta una nuova strategia di multiplexing, madSTORM, in cui molecole multiple sono mirate nella stessa cellula usando sequenziali e eluendo degli anticorpi fluorescenti. MadSTORM è dimostrato su una cellula T attivata per visualizzare le posizioni di diversi componenti all'interno di una struttura a più proteine legata alla membrana chiamata microcluster del recettore cellulare T. Inoltre, viene discussa l'applicazione di madSTORM come strumento generale per la visualizzazione di strutture multi-proteine.
Introduction
Sono state sviluppate varie tecniche di microscopia super-risoluzione per superare il limite di diffrazione della microscopia leggera (~ 200 nm). Tra queste è una categoria di tecniche chiamate microscopia di localizzazione singola (SMLM) che comprende microscopia di localizzazione foto-attivazione (PALM) e microscopia ottica stoccastica di ricostruzione (STORM). Le tecniche SMLM condividono l'uso di fluorofori che possono essere commutati tra stati (fluorescenti) e fuori (scuri / foto-commutati), consentendo la localizzazione sequenziale della fluorescenza da singole molecole 1 , 2 , 3 .
Grazie alla sua compatibilità con i coloranti e microscopi commercialmente disponibili, STORM diretto (dSTORM) è diventato una tecnica SMLM ampiamente adottata 4 . DSTORM riesce a raggiungere normalmente una precisione di localizzazione ~ 10 nm, definita come l'incertezza nel calcolo del centro di un diffractFunzione di diffusione a punti ioni-limitata (PSF). Tuttavia, nonostante l'alta precisione stimata utilizzando gli algoritmi di localizzazione 5 , 6 , 7 , un'accurata determinazione della posizione effettiva delle singole molecole è stata ostacolata da una serie di problemi. Innanzitutto, il movimento meccanico dello stadio microscopico durante l'acquisizione di immagini aggiunge un'incertezza significativa alla precisione di localizzazione. Poiché le immagini SMLM sono ottenute in migliaia di frame di scadenza, i movimenti nano-scala dello stadio microscopico possono compromettere in modo significativo la precisione dell'immagine finale super-risoluzione 8 . Per compensare il movimento della fase durante l'acquisizione dell'immagine, la deriva di fase è comunemente stimata dalla raccolta a regressione di localizzazioni binned dall'immagine stessa (correlazione incrociata) o localizzazioni sequenziali da marcatori fiduciali (correzione fiduciaria) 1 , 9 . CarnQuesti metodi richiedono l'ottimizzazione di più parametri per ogni stack di immagini e non possono rappresentare i movimenti di fase in scala temporanea come la vibrazione meccanica. Nano-particelle d'oro e perline fluorescenti multicolori sono state utilizzate come marcatori fiduciali in SMLM ma non sono foto-stabili e risultano in una precisione notevolmente inferiore dopo la correzione della deriva rispetto ai nano-diamanti fluorescenti (FND) In madSTORM 10 .
Oltre al limite di diffrazione, la microscopia leggera è ulteriormente limitata dai limiti spettrali. La visualizzazione simultanea di bersagli multipli richiede sonde fluorescenti con profili spettrali non sovrapposti, generalmente limitando la microscopia leggera a fluorescenza a 6 colori e SMLM a 2-3 colori 4 , 11 , 12 . Inoltre, l'aberrazione cromatica non lineare provoca un disallineamento di immagini multicolor, wChe richiedono procedure di allineamento estese utilizzando marcatori fiduciali multicolori 8 , 13 . Per ovviare a questi limiti, studi precedenti hanno ripreso obiettivi multipli con fotopolimerizzazione ripetuta o spegnimento chimico dei fluorofori sequenzialmente legati 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 . Mentre questi metodi possono superare i limiti spettrali della microscopia, il sbiancamento di fluorescenza è noto per essere un processo tossico 20 e uno sbiancamento prolungato o uno spegnimento può causare effetti collaterali indesiderati, come la perdita di reticolazione. Inoltre, l'accumulo di sonde fluorescenti potrebbe portare a blocchi sterici di siti di legame nel campione, impedendo la multiplexing su larga scala e il targeting robusto di epitopi. Per evitare tali interferenze steriche, un recente sHa ottenuto la multiplexing utilizzando uno scambio stocastico di frammenti proteici liberamente diffusi 21 . Mentre questo metodo consente una densa etichettatura delle strutture cellulari, richiede un'ampia preparazione biochimica per isolare i frammenti peptidici, non individuare posizioni singole molecole e non agevolmente agevolare il multiplexing su larga scala utilizzando sonde commercialmente disponibili. Presentiamo un protocollo video dettagliato che descrive il legame sequenziale e l'eluzione di anticorpi fluorescenti per l'imaging dSTORM (madSTORM) multiplexato con dimensioni corporee e l'utilizzo di nano diamanti fluorescenti per ottenere una corretta correzione e allineamento della deriva.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le procedure di multiplexing sequenziali, di correzione della deriva e di allineamento in madSTORM consentono una visualizzazione precisa e altamente multipleplazionale delle strutture eterogenee nelle cellule. 10 Inoltre, madSTORM evita le limitazioni di STORM multicolore, come l'aberrazione cromatica e le proprietà di scambio fotovoltaico / emissioni sub-ottimali di coloranti rossi non lontani 9 , 12 . Poiché la fase di eluizione …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo Xufeng Wu per l'accesso al microscopio STORM. Questa ricerca è stata sostenuta dal Programma Intramurale di Ricerca del National Cancer Institute (NCI) Centro per la Ricerca sul Cancro e dal National Heart Lung and Blood Institute (NHLBI).
Materials
| 8 well coverslip chamber | Lab-tek | 155409 | |
| 0.1% Poly-L-Lysine solution | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| NV-100nm Fluorescent Nano-diamond | Adamas | Red FND | |
| anti-CD3ε antibody | BD Biosciences | 555329 | |
| Bovine serum albumin, Fraction V | KSE Scientific | 98-100P | |
| Triton-X | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| 10% Paraformaldehyde | EMS | 15712 | Carcinogen |
| Gelatin from fresh water fish skin | Sigma-Aldrich | G7041 | |
| Alexa 647 antibody labeling kit | Thermo Fisher | A20186 | |
| Magnesium Chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | 138924 | |
| PIPES | Sigma-Aldrich | P6757 | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M7154 | Highly toxic, air sensitive |
| Cysteamine | Sigma-Aldrich | 30070 | Highly toxic |
| Cyclooctatetraene 98% | Sigma-Aldrich | 138924 | Highly toxic, air sensitive |
| 10x PBS | KD Medical | RGF-3210 | |
| 10x TBS | KD Medical | RGF-3385 |
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