Transplantation de cellules germinales primordiales pour base CRISPR/Cas9 saute-mouton chez Xenopus
Summary
Gènes essentiels à la survie posent des obstacles techniques pour créer des lignées mutantes. Saute-mouton contourne la létalité en combinant génome édition avec la transplantation de cellules germinales primordiales pour créer des animaux sauvage porteurs de mutations germinales. Brûler les étapes permet également la génération efficace des homozygotes mutants null dans la génération de1 F. Ici, l’étape de la transplantation est démontrée.
Abstract
La création de lignées mutantes en éditant de génome s’accélère l’analyse génétique chez de nombreux organismes. Méthodes CRISPR/Cas9 ont été adaptés à l’africaine Xenopus laevis, Xenopus, un organisme modèle de longue date pour la recherche biomédicale. Régimes de reproduction traditionnelle pour la création de lignées mutantes homozygotes avec mutagénèse CRISPR/Cas9-ciblés ont plusieurs étapes longues et laborieuses. Pour faciliter la création d’embryons mutants, notamment pour surmonter les obstacles associés à assommer les gènes qui sont essentiels pour l’embryogénèse, une nouvelle méthode appelée Bond a été développée. Cette technique s’appuie sur la robustesse des embryons de Xenopus à « copier / coller » méthodes embryologiques. Saute-mouton utilise le transfert de cellules germinales primordiales (PGC) provenant d’embryons de donneurs efficacement-mutagénisées tant en frères et sœurs PGC-ablation de type sauvage. Cette méthode permet une mutation efficace de gènes essentiels en créant des animaux chimériques avec cellules somatiques de type sauvage qui transportent un mutant germline. Lorsque deux animaux de0 F porteurs « leapfrog greffes » (c’est-à-dire, les cellules germinales mutant) sont intercroisées, ils produisent des homozygotes, ou hétérozygotes, null F1 embryons, sauvant ainsi un temps de génération complet pour obtenir des données phénotypiques. Saute-mouton fournit également une nouvelle approche pour l’analyse des gènes effet maternel qui sont réfractaires à l’analyse phénotypique0 F suite CRISPR/Cas9 mutagenèse. Ce manuscrit détaille la méthode de brûler les étapes, avec un accent particulier sur la façon de réaliser avec succès la transplantation du PGC.
Introduction
Comment le génotype encode phénotype a été une question majeure en biologie depuis la redécouverte des lois de Mendel. Comprendre les rôles des gènes, leur régulation et interactions au sein des réseaux de gènes et les fonctions des promesses de produits codés de fournir des outils pour découvrir nouvelle biologie et amélioration des états pathologiques. Pour plus d’un demi siècle1, l’africaine Xenopus laevis, Xenopus, a été un modèle pour les études sur un large éventail de sujets en biologie fondamentale et de la biomédecine, y compris le contrôle génétique du développement. Historiquement, la plupart des recherches sur Xenopus a utilisé la grenouille allotétraploïde, X. laevis, mais plus récemment, en raison de la diploïdie, X. tropicalis a été conçu comme un modèle génétique amphibie. Séquences de génomes complets ont été assemblés entre les deux espèces de Xenopus 2,3. La « communauté de la grenouille » est maintenant à un moment charnière où la technologie de modification du génome de base permet l’étude de la fonction des gènes, pratiquement à volonté. Programmable CRISPR/Cas9 endonucléases ont fait la mutagénèse de gènes très efficace, avec mutations bialléliques possible dans la plupart des cellules de l’animal4,5,6,7, 8,9,10,11. Ces études, mise en évidence par Blais et al. 12 et Shigeta et al. 13, ont montré que la fonction de plusieurs gènes peut être étudiée par mutagenèse chez les animaux de mosaïque de0 F. Cette approche présente de nombreux avantages ; Cependant, embryons Cas9-sgRNA-micro affichent souvent des phénotypes variables en raison de la perte incomplète de la fonction (LOF). Plus important encore, la génération des lignées mutantes est très avantageuse pour certaines applications, en particulier lorsque l’on étudie les gènes qui ont une contribution d’ARNm maternels. ARNm maternels et protéines et leurs influences sur l’épigénétique, persistent pendant une longue période dans l’embryogenèse14,15,16, rendant les contributions du développement précoces de plusieurs gènes réfractaire aux analyses de0 F. Par conséquent, les autres approches LOF sont nécessaires.
Lorsqu’on cherche à créer des lignées mutantes, le chemin d’accès à l’obtention d’embryons homozygotes de LOF a plusieurs obstacles. Mutagenèse tout d’abord, efficace pour produire des mutations bialléliques peut être désavantageux car perte des fonctions des gènes essentiels se traduit par l’incapacité à survivre à la maturité sexuelle, interférant avec la production d’une ligne viable. Une solution commune est le titrage minutieux d’un montant de Cas9-sgRNA envoyée. Ici, l’objectif est d’atteindre un équilibre entre réduction de létalité tout en optimisant également l’efficacité de la lignée germinale mutagenèse. Un autre problème se pose du schéma standard d’élevage, où les analyses phénotypiques sont différés jusqu’à la génération de2 F. À l’aide de l’approche standard, sexuellement matures animaux de0 F qui transmettent mutant allèles par le biais de la lignée germinale sont croisées pour produire des F1 hétérozygote « entreprises », qui sont ensuite cultivées à la maturité sexuelle. Deux hétérozygotes de1 F sont ensuite intercroisées pour produire des embryons mutants, F2 à une fréquence mendélienne prévue de 25 %. Ainsi, deux générations d’élevage sont nécessaires pour l’analyse des phénotypes mutants. Animaux mutants pourrait être homozygotes ou hétérozygotes (c.-à-d. descendants contenant deux allèles mutants différents, qui dépend des génotypes des parents animaux utilisés dans la population de1 F).
Ces obstacles peuvent être surmontés en limitant programmable mutagenèse induite par la nucléase de cellules germinales, qui sous-tend une nouvelle méthode appelée former17. Saute-mouton possède deux composantes principales : (1) la microinjection des ARNm de Cas ainsi que sgRNA ou nucléase-sgRNA complexes (ou, en principe, TALENs ou zinc nucléases de doigt) au stade unicellulaire de mutagenize efficacement les génomes embryonnaires, suivie (2) la transplantation de PGC dans des embryons de frère de type sauvage, où le PGC endogènes ont été supprimés. Quand les deux étapes sont le remplacement de germline efficace, complète avec les cellules germinales mutantes peut être obtenue. Blackler démontré dans les années 1960 que Xenopus PGC pourrait être transplanté entre embryons à la neurula fin et18,de stades précoces tailbud19. Pour brûler les étapes, l’approche de Blackler modification en effectuant les transplantations d’organes au stade blastula17, lorsque PGC est localisées dans le pôle végétal de l’embryon20,21. Transplantation avant la gastrulation a deux principaux avantages. Tout d’abord, la prise de greffe des greffes et le développement subséquent de normal s’est avéré plus efficace lorsque la greffe est réalisée au stade blastula (inédites). Deuxièmement, en effectuant des transplantations d’organes stade blastula peu après que transcription zygotique a commencé, on peut éviter la létalité découlant du développement génétique mutations qui perturbent la gastrulation, ou qui autrement mener à neurula fin malformé. PGC transplantation portant les embryons (« leapfrogged ») sont cultivés à la maturité sexuelle, et les croisements entre ces animaux de0 F ont démontré que, dans bien des cas, 100 % de la progéniture de1 F afficher le phénotype LOF (la plupart étant composé hétérozygotes), indiquant la lignée germinale complète de remplacement avec les mutations ciblées.
Il est prévu que Bond s’accélérera les approches génétiques chez Xenopus. Brûler les étapes prévoit également une alternative à la méthode de « transfert d’accueil »22 pour l’analyse LOF des gènes effet maternel (inédites). Dans la présente publication, une description détaillée de la méthode, en focalisant sur la transplantation de PGC, est présentée dans X. tropicalis (avec des modifications mineures pour X. laevis). La transplantation du PGC est démontrée ici, pour faciliter un transfert plus rapid de cette technologie à d’autres laboratoires qui travaillent avec Xenopus. Les principes de cette méthode doivent être réussies chez les autres amphibiens (p. ex., urodèles), et modifications de l’organisme-spécifiques dans la méthodologie devraient permettre pour application à de nombreux autres animaux dont mutagénèse efficace peut être accompli et PGC est facilement transplantables.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ce rapport fournit un protocole détaillé pour la transplantation de tissu végétal contenant PGC. Transplantation de PGC est utilisé en conjonction avec les technologies de modification du génome (p. ex., CRISPR/Cas9) pour modifier les cellules germinales d’un animal tout en maintien de la quasi-totalité de ses tissus somatiques comme génétiquement le type sauvage. Pour brûler les étapes pour réussir, il y a un certain nombre de facteurs critiques à considérer avant d’effectuer des transplantati…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été réalisé avec le soutien d’une subvention, 5R21HD080684-02, de l’Institut National de santé de l’enfant et le développement humain. L’auteur tient à remercier Ken Cho pour son enthousiasme et le soutien continus. L’auteur tiens également à remercier Bruce Blumberg utilisation de sa caméra, Rébecca Charney, à la lecture critique du manuscrit et Sean McNamara et Marcin Wlizla à la ressource nationale de Xenopus (RRID:SCR_013731), pour le précieux conversations au sujet de X. tropicalis d’alimentation et de régimes de protection des animaux.
Materials
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11252-20 or 11252-30 | |
| Eyebrow hair knife | Homemade | ||
| Hair loop | Homemade | ||
| Pasteur pipettes, borosilicate glass | Fisher Scientific | 13-678-20A | |
| Krazy Glue (Cyanoacrylate-based) | Elmer's Products, Inc. | KG581 | To affix eyebrow hair and hair loops into Pasteur pipettes, other similar glues can be used. |
| Oligodeoxynucleotides, custom ordered | Integrated DNA Technologies | Custom ordered | Template oligos for sgRNA synthesis, see Nakayama et al., 2014 for design details. |
| Megascript T7 kit | Ambion/ThermoFisher | AM1334 | Or use Megashortscript T7 (AM1354) kit |
| Phenol, Tris buffered | High quality distilled phenol from any commercial supplier | ||
| Chloroform | High quality chloroform from any commercial supplier | ||
| Ethanol | High quality ethanol from any commercial supplier | ||
| Diethylpyrocarbonate (DEPC) | Sigma Chemical Co. | D5758-50ML | |
| Cas9 protein, with nuclear localization signal | PNA Bio, Inc. | CP01 | Reconstituted using DEPC-treated water according to manufacturer's recommendations |
| 10X Marc's Modified Ringers solution | Homemade. Recipe (ref 26) for 1X MMR (lacking EDTA) is 100mM NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 5 mM HEPES. Solution is pH adjusted to 7.4. | ||
| Agarose | Any Molecular Biology grade agarose is sufficient | ||
| 60 X15 mm Petri plates | Falcon | 351007 | |
| 24-well plates | Falcon | 3047 | |
| L-Cysteine | Sigma Chemical Co. | C7352-100G | Free base, not HCl salt |
| Proteinase K | Roche | 03 115 828 001 | Typically ~20mg/ml from Roche |
| sera Micron | sera | Tadpole food. Resuspend in growth medium. Can be purchased from a variety of online retailers |
References
- Gurdon, J. B., Hopwood, N. The introduction of Xenopus laevis into developmental biology: of empire, pregnancy testing and ribosomal genes. Int J Dev Biol. 44 (1), 43-50 (2000).
- Hellsten, U., et al. The genome of the Western clawed frog Xenopus tropicalis. Science. 328 (5978), 633-636 (2010).
- Session, A. M., et al. Genome evolution in the allotetraploid frog Xenopus laevis. Nature. 538 (7625), 336-343 (2016).
- Blitz, I. L., Biesinger, J., Xie, X., Cho, K. W. Biallelic genome modification in F(0) Xenopus tropicalis embryos using the CRISPR/Cas system. Genesis. 51 (12), 827-834 (2013).
- Nakayama, T., Fish, M. B., Fisher, M., Oomen-Hajagos, J., Thomsen, G. H., Grainger, R. M. Simple and efficient CRISPR/Cas9-mediated targeted mutagenesis in Xenopus tropicalis. Genesis. 51 (12), 835-843 (2013).
- Guo, X., et al. Efficient RNA/Cas9-mediated genome editing in Xenopus tropicalis. Development. 141 (3), 707-714 (2014).
- Wang, F., Shi, Z., Cui, Y., Guo, X., Shi, Y. B., Chen, Y. Targeted gene disruption in Xenopus laevis using CRISPR/Cas9. Cell Biosci. 5, 15 (2015).
- Jaffe, K. M., et al. c21orf59/kurly Controls Both Cilia Motility and Polarization. Cell Rep. 14 (8), 1841-1849 (2016).
- Liu, Z., et al. Efficient genome editing of genes involved in neural crest development using the CRISPR/Cas9 system in Xenopus embryos. Cell Biosci. 6, 22 (2016).
- Naert, T., et al. CRISPR/Cas9 mediated knockout of rb1 and rbl1 leads to rapid and penetrant retinoblastoma development in Xenopus tropicalis. Sci Rep. 6 (35264), (2016).
- Ratzan, W., Falco, R., Salanga, C., Salanga, M., Horb, M. E. Generation of a Xenopus laevis F1 albino J strain by genome editing and oocyte host-transfer. Dev Biol. 426 (2), (2016).
- Bhattacharya, D., Marfo, C. A., Li, D., Lane, M., Khokha, M. K. CRISPR/Cas9: An inexpensive, efficient loss of function tool to screen human disease genes in Xenopus. Dev Biol. 408 (2), 196-204 (2015).
- Shigeta, M., et al. Rapid and efficient analysis of gene function using CRISPR-Cas9 in Xenopus tropicalis founders. Genes Cells. 21 (7), 755-771 (2016).
- Hontelez, S., et al. Embryonic transcription is controlled by maternally defined chromatin state. Nat Commun. 6, 10148 (2015).
- Peshkin, L., et al. On the Relationship of Protein and mRNA Dynamics in Vertebrate Embryonic Development. Dev Cell. 35 (3), 383-394 (2015).
- Owens, N. D., et al. Measuring Absolute RNA Copy Numbers at High Temporal Resolution Reveals Transcriptome Kinetics in Development. Cell Rep. 14 (3), 632-647 (2016).
- Blitz, I. L., Fish, M. B., Cho, K. W. Leapfrogging: primordial germ cell transplantation permits recovery of CRISPR/Cas9-induced mutations in essential genes. Development. 143 (15), 2868-2875 (2016).
- Blackler, A. W. Transfer of germ-cells in Xenopus laevis. Nature. 185, 859-860 (1960).
- Blackler, A. W., Fischberg, M. Transfer of primordial germ-cells in Xenopus laevis. J Embryol. Exp Morph. 9, 634-641 (1961).
- Bounoure, L. . L’origine des cellules reproductrices et le problem de la lignee germinale. , (1939).
- Nieuwkoop, P. D., Sutasurya, L. A. . Primordial Germ Cells in the Chordates: Embryogenesis and phylogenesis. , (1979).
- Heasman, J., Holwill, S., Wylie, C. C. Fertilization of cultured Xenopus oocytes and use in studies of maternally inherited molecules. Methods Cell Biol. 36, 213-230 (1991).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Embryo dissection and micromanipulation tools. CSH Protoc. , (2007).
- Nakayama, T., et al. Cas9-based genome editing in Xenopus tropicalis. Methods Enzymol. 546, 355-375 (2014).
- Ogino, H., McConnell, W. B., Grainger, R. M. High-throughput transgenesis in Xenopus using I-SceI meganuclease. Nat Protoc. 1 (4), 1703-1710 (2006).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. . Early development of Xenopus laevis.: a laboratory manual. , (2000).
- Kay, B. K., Kay, B. K., Peng, H. B. Injection of oocytes and embryos. Xenopus laevis: Practical Uses in Cell and Molecular Biology (Methods in Cell Biology Vol. 36). , (1991).
- Nieuwkoop, P., Faber, J. . Normal Table of Xenopus laevis. (Daudin): A Systematical and Chronological Survey of the Development from the Fertilized Egg till the End of Metomorphosis. , (1994).
- Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition. Nucleic Acids Res. 42 (22), e168 (2014).
- Sander, V., Reversade, B., De Robertis, E. M. The opposing homeobox genes Goosecoid and Vent1/2 self-regulate Xenopus patterning. EMBO J. 26 (12), 2955-2965 (2007).
- Bedell, V. M., et al. In vivo genome editing using a high-efficiency TALEN system. Nature. 491 (7422), 114-118 (2012).
- Kim, J. M., Kim, D., Kim, S., Kim, J. S. Genotyping with CRISPR-Cas-derived RNA-guided endonucleases. Nat Commun. 5, 3157 (2014).
- Kim, H. J., Lee, H. J., Kim, H., Cho, S. W., Kim, J. S. Targeted genome editing in human cells with zinc finger nucleases constructed via modular assembly. Genome Res. 19 (7), 1279-1288 (2009).
- Qiu, P., Shandilya, H., D’Alessio, J. M., O’Connor, K., Durocher, J., Gerard, G. F. Mutation detection using Surveyor nuclease. Biotechniques. 36 (4), 702-707 (2004).
- Ota, S., et al. Efficient identification of TALEN-mediated genome modifications using heteroduplex mobility assays. Genes Cells. 18 (6), 450-458 (2013).
- Dahlem, T. J., et al. Simple Methods for Generating and Detecting Locus- Specific Mutations Induced with TALENs in the Zebrafish Genome. PLoS Genet. 8 (8), e1002861 (2012).
- Ramlee, M. K., Yan, T., Cheung, A. M., Chuah, C. T., Li, S. High-throughput genotyping of CRISPR/Cas9-mediated mutants using fluorescent PCR-capillary gel electrophoresis. Sci Rep. 5, 15587 (2015).
- Bhattacharya, D., Marfo, C. A., Li, D., Lane, M., Khokha, M. K. CRISPR/Cas9: An inexpensive, efficient loss of function tool to screen human disease genes in Xenopus. Dev Biol. 408 (2), 196-204 (2015).
- Yu, C., Zhang, Y., Yao, S., Wei, Y. A PCR Based Protocol for Detecting Indel Mutations Induced by TALENs and CRISPR/Cas9 in Zebrafish. PLoS ONE. 9 (6), e98282 (2014).
- Mock, U., Hauber, I., Fehse, B. Digital PCR to assess gene-editing frequencies (GEF-dPCR) mediated by designer nucleases. Nat Protoc. 11 (3), 598-615 (2016).
- Varshney, G. K., et al. High-throughput gene targeting and phenotyping in zebrafish using CRISPR/Cas9. Genome Res. 25 (7), 1030-1042 (2015).
- Shi, J., Wang, E., Milazzo, J. P., Wang, Z., Kinney, J. B., Vakoc, C. R. Discovery of cancer drug targets by CRISPR-Cas9 screening of protein domains. Nat Biotechnol. 33 (6), 661-667 (2015).
- Koebernick, K., Loeber, J., Arthur, P. K., Tarbashevich, K., Pieler, T. Elr-type proteins protect Xenopus Dead end mRNA from miR-18-mediated clearance in the soma. Proc Natl Acad Sci USA. 107, 16148-16153 (2010).
- Yang, J., Aguero, T., King, M. L. The Xenopus maternal-to-zygotic transition from the perspective of the germline. Curr Top Dev Biol. 113, 271-303 (2015).
