השתלת תא נבט הקדמוני עבור מבוססת על CRISPR/Cas9 וקפיצת המדרגה של צפרדע רפואית
Summary
גנים חיוניים להישרדות מהווים מכשולים טכניים עבור יצירת שורות מוטציה. קפיצת מדרגה עוקף קטלני על-ידי שילוב הגנום עריכה עם השתלת תא נבט הקדמונים ליצירת חיות פראי-סוג נושאת germline מוטציות. קפיצת מדרגה מאפשרת גם הדור יעיל של מוטציות null homozygous דור1 F. . הנה, הצעד השתלת הוא הפגין.
Abstract
היצירה של מוטציה שורות על-ידי עריכת הגנום מאיצה ניתוח גנטי של אורגניזמים רבים. CRISPR/Cas9 שיטות הותאמו לשימוש באפריקה שנחטף ייזרק צפרדע, צפרדע רפואית, אורגניזם מודל ארוכת שנים המחקר הביו-רפואי. רבייה מסורתיים ערכות ליצירת קווים מוטציה homozygous עם CRISPR/Cas9-ממוקד מוטגנזה מכוונת יש מספר שלבים ההגדרה המפורטת. כדי להקל על יצירת עוברים מוטציה, במיוחד כדי להתגבר על מכשולים הקשורים לדפוק גנים חיוניים מופרה, פותחה שיטה חדשה הנקראת קפיצת מדרגה. טכניקה זו ממנפת את היציבות של עוברי צפרדע רפואית כדי “גזור והדבק” שיטות embryological. קפיצת מדרגה מנצל את העברת בתאי הנבט הקדמוני (PGCs) מעוברים התורם mutagenized ביעילות לתוך wildtype PGC ablated אחים. שיטה זו מאפשרת המוטציה יעיל של גנים חיוניים על-ידי יצירת חיות chimeric עם תאים סומטיים wildtype שנושאים germline מוטציה. כאשר שתי חיות F0 נושאים “” קפיצות חמור “השתלות” (קרי, מוטציה בתאי הנבט) הם intercrossed, הם מייצרים homozygous, או מתחם משפחתית ולא משפחתית הטרוזיגוטיים, null F1 עוברי, ובכך לחסוך זמן דור מלא כדי לקבל נתונים פנוטיפי. קפיצת מדרגה מספק גם גישה חדשה לניתוח אפקט אימהי גנים, אשר הם דברים מעוותים F0 פנוטיפי ניתוח בעקבות מוטגנזה מכוונת CRISPR/Cas9. כתב יד זה מפרט את שיטת קפיצת מדרגה, עם דגש מיוחד על איך לבצע בהצלחה השתלת PGC.
Introduction
איך מקודד גנוטיפ פנוטיפ כבר שאלה גדולה בביולוגיה מאז גילויה מחדש של חוקי מנדל. הבנה של התפקידים של גנים, רגולציה שלהם ואינטראקציות בתוך רשתות ג’ין, הפונקציות של מוצרים מקודד הבטחות כדי לספק כלים עבור חשיפת ביולוגיה חדש ועם מצבי מחלה ameliorating. במשך יותר מחצי מאה1, הצפרדע שנחטף ייזרק אפריקאי, צפרדע רפואית, כבר דוגמנית מובילה ללימודי במגוון רחב של נושאים בסיסיים בביולוגיה, וההתערבות, כולל הבקרה הגנטית של פיתוח. מבחינה היסטורית, רוב המחקרים על צפרדע רפואית השתמשה הצפרדע allotetraploid, X. laevis, אך לאחרונה, בשל diploidy שלה, X. tropicalis פותחה כמודל גנטי דו-חיים. רצף הגנום המלא יש הורכב מ2,שני מינים צפרדע רפואית 3. “קהילה צפרדע” הוא עכשיו נקודת מפנה שבו הגנום בסיסי שינוי הטכנולוגיה מאפשרת המחקר של תפקוד הגן, כמעט כרצונו. Endonucleases CRISPR/Cas9 לתכנות הפכו את מוטגנזה מכוונת של גנים יעילים ביותר, עם biallelic מוטציה אפשרית בתאים רוב של בעלי חיים4,5,6,7, 8,9,10,11. מחקרים אלה, על-ידי Bhattacharya. et al. 12 ו. Shigeta et al. 13, הראו כי הפונקציה של גנים רבים ניתן יהיה ללמוד על ידי מוטגנזה מכוונת בבעלי פסיפס של F0 . גישה זו יש יתרונות רבים; עם זאת, Cas9-sgRNA-microinjected עוברי מוצג לרוב פנוטיפים משתנה בשל אובדן לא שלם של פונקציה (LOF). יותר באופן משמעותי, של קווים מוטציה הדור יש יתרון מאוד עבור יישומים מסוימים — בפרט לומדים גנים בעלי תרומה mRNA אימהית. MRNAs האימהי ואת החלבונים והשפעות שלהם על אפיגנטיקה, נמשכות לתקופה ממושכת לתוך מופרה14,15,16, מתן תרומות התפתחותי מוקדם של גנים רבים חסיני אש ל F0 ניתוחים. לכן, גישות אחרות LOF נדרשים.
כאשר המבקשים ליצור קווים מוטציה, הדרך להשגת עוברי LOF homozygous יש מספר מכשולים. מוטגנזה מכוונת הראשון, יעיל לייצר מוטציות biallelic יכול להיות חסרון כי אובדן של גנים חיוניים פונקציות התוצאה היא כשל כדי לשרוד עד לבגרות מינית, הפרעה בייצור קו קיימא. פתרון משותף הוא טיטרציה זהירה של כמות Cas9-sgRNA משלוח. כאן, המטרה היא להשיג איזון בין הפחתת lethality תוך מיקסום גם germline מוטגנזה מכוונת יעילות. בעיה נוספת נובעת ערכת גידול רגיל, איפה ניתוחים פנוטיפי הם נדחים עד הדור2 F. באמצעות גישה סטנדרטי, בוגרת מינית F0 חיות המעבירים מוטציה אללים דרך germline הם outcrossed כדי לייצר F1 “שירות heterozygous”, אשר לאחר מכן גדלים לבגרות מינית. שני F1 heterozygotes הם intercrossed ואז לייצר F2 עוברים מוטציה בתדר Mendelian הצפויה של 25%. לכן, שני דורות של רבייה נחוצים לצורך ניתוח של פנוטיפים מוטציה. חיות יכול להיות homozygotes או תרכובת heterozygotes (קרי, כשהיא המכיל שני אללים mutant שונים, תלוי אחרים של החיות הורים המשמשים את intercross1 F).
מכשולים אלה ניתן להתגבר על ידי כליאת לתכנות בתיווך נוקלאז מוטגנזה מכוונת לתאי נבט, המונחת שיטה חדשה הנקראת קפיצת מדרגה17. קפיצת מדרגה מכיל שני רכיבים מרכזיים: (1) microinjection של mRNA Cas יחד עם sgRNA, או קומפלקסים נוקלאז-sgRNA (או, עקרון, TALENs או אבץ אצבע nucleases) בשלב תא בודד כדי ביעילות mutagenize הגנום העוברי, ואחריו (2) השתלת של PGCs לתוך wildtype עוברי אח, איפה PGCs אנדוגני הוסרו. ניתן להשיג בשני שלבים את מועד החלפת germline יעילה, להשלים עם מוטציה בתאי הנבט. Blackler הפגינו בשנות ה-60 המוקדמות כי יכול להיות מושתלים צפרדע רפואית PGCs בין עוברי-neurula מאחר מוקדם tailbud שלבים18,19. עבור קפיצת מדרגה, הגישה של Blackler שונתה על-ידי ביצוע של השתלות על הבמה blastula17, כאשר PGCs מותאמים במוט vegetal20,עובר21. השתלת לפני gastrulation יש שני יתרונות עיקריים. קודם כל, engraftment של השתלות, להתפתחות תקינה לאחר מכן נמצאה כדי להיות יעיל יותר כאשר השתלת מבוצע בשלב blastula (שלא פורסמו תצפיות). שנית, על ידי ביצוע השתלות blastula-שלב זמן קצר לאחר תחילת שעתוק zygotic, אחד לא יכול למנוע את הקטלניות הנובעים ג’ין התפתחותית מוטציות לשבש gastrulation או אחרת להוביל neurulae מאוחר בעלת מבנה פגום. עוברי (“עד”) השתלת מניבי PGC בוגרים לבגרות מינית, intercrosses בין בעלי חיים אלה F0 הדגימו כי, במקרים רבים, 100% צאצאים1 F להציג את פנוטיפ LOF (רוב להיות מורכבים heterozygotes), המציינת את החלפת germline להשלים עם מוטציות יישוב.
הוא צפוי כי קפיצת מדרגה נאיץ את גישות גנטיות בצפרדע רפואית. קפיצת מדרגה גם מספק אלטרנטיבה שיטת “לארח העברה”22 לניתוח LOF של גנים אמהי-אפקט (שלא פורסמו תצפיות). בפרסום הנוכחי, מוצג תיאור מפורט של השיטה, במיוחד התמקדות PGC ההשתלה, X. tropicalis (עם שינויים מזעריים עבור X. laevis). ההשתלה של PGCs הוא הפגין כאן כדי להקל על העברה מהירה יותר של טכנולוגיה זו למעבדות אחרות לעבוד עם צפרדע רפואית. עקרונות שיטה זו צריכה להיות מוצלחת דו-חיים אחרים (למשל, urodeles), וגם שינויים האורגניזם הספציפי של המתודולוגיה צריכה מאפשרים ליישום חיות רבות אחרות שבהן מוטגנזה מכוונת יעיל יכול להתבצע, PGCs הם ברצון שיפותחו.
Protocol
Representative Results
Discussion
דוח זה מספק את פרוטוקול מפורט עבור השתלת רקמת צמחי המכיל PGCs. השתלת של PGCs נמצא בשימוש בשילוב עם טכנולוגיות לעריכת הגנום (לדוגמה, CRISPR/Cas9) כדי לשנות את germline של חיה בזמן שמירה על כמעט את כל הרקמות סומאטית שלה כסוג הפרוע גנטית. עבור קפיצת מדרגה מוצלח, ישנם מספר גורמים קריטיים שיש לקחת בחשבון ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו בוצעה עם התמיכה של מענק, 5R21HD080684-02, מן המכון הלאומי לבריאות הילד והתפתחות האדם. המחבר מבקש להודות קן צ’ו שלו התלהבות ותמיכה מתמשכת. המחבר גם רוצה להכיר ברוס בלומברג לשימוש של המצלמה שלו, רבקה צ’רני, לקריאה ביקורתית של כתב היד, ואת שון מקנמרה, מרצ’ין Wlizla-המשאב הלאומי צפרדע רפואית (RRID:SCR_013731), עבור היקרה ערך שיחות בנוגע X. tropicalis האכלה, טיפול בבעלי חיים משטרי.
Materials
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11252-20 or 11252-30 | |
| Eyebrow hair knife | Homemade | ||
| Hair loop | Homemade | ||
| Pasteur pipettes, borosilicate glass | Fisher Scientific | 13-678-20A | |
| Krazy Glue (Cyanoacrylate-based) | Elmer's Products, Inc. | KG581 | To affix eyebrow hair and hair loops into Pasteur pipettes, other similar glues can be used. |
| Oligodeoxynucleotides, custom ordered | Integrated DNA Technologies | Custom ordered | Template oligos for sgRNA synthesis, see Nakayama et al., 2014 for design details. |
| Megascript T7 kit | Ambion/ThermoFisher | AM1334 | Or use Megashortscript T7 (AM1354) kit |
| Phenol, Tris buffered | High quality distilled phenol from any commercial supplier | ||
| Chloroform | High quality chloroform from any commercial supplier | ||
| Ethanol | High quality ethanol from any commercial supplier | ||
| Diethylpyrocarbonate (DEPC) | Sigma Chemical Co. | D5758-50ML | |
| Cas9 protein, with nuclear localization signal | PNA Bio, Inc. | CP01 | Reconstituted using DEPC-treated water according to manufacturer's recommendations |
| 10X Marc's Modified Ringers solution | Homemade. Recipe (ref 26) for 1X MMR (lacking EDTA) is 100mM NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 5 mM HEPES. Solution is pH adjusted to 7.4. | ||
| Agarose | Any Molecular Biology grade agarose is sufficient | ||
| 60 X15 mm Petri plates | Falcon | 351007 | |
| 24-well plates | Falcon | 3047 | |
| L-Cysteine | Sigma Chemical Co. | C7352-100G | Free base, not HCl salt |
| Proteinase K | Roche | 03 115 828 001 | Typically ~20mg/ml from Roche |
| sera Micron | sera | Tadpole food. Resuspend in growth medium. Can be purchased from a variety of online retailers |
References
- Gurdon, J. B., Hopwood, N. The introduction of Xenopus laevis into developmental biology: of empire, pregnancy testing and ribosomal genes. Int J Dev Biol. 44 (1), 43-50 (2000).
- Hellsten, U., et al. The genome of the Western clawed frog Xenopus tropicalis. Science. 328 (5978), 633-636 (2010).
- Session, A. M., et al. Genome evolution in the allotetraploid frog Xenopus laevis. Nature. 538 (7625), 336-343 (2016).
- Blitz, I. L., Biesinger, J., Xie, X., Cho, K. W. Biallelic genome modification in F(0) Xenopus tropicalis embryos using the CRISPR/Cas system. Genesis. 51 (12), 827-834 (2013).
- Nakayama, T., Fish, M. B., Fisher, M., Oomen-Hajagos, J., Thomsen, G. H., Grainger, R. M. Simple and efficient CRISPR/Cas9-mediated targeted mutagenesis in Xenopus tropicalis. Genesis. 51 (12), 835-843 (2013).
- Guo, X., et al. Efficient RNA/Cas9-mediated genome editing in Xenopus tropicalis. Development. 141 (3), 707-714 (2014).
- Wang, F., Shi, Z., Cui, Y., Guo, X., Shi, Y. B., Chen, Y. Targeted gene disruption in Xenopus laevis using CRISPR/Cas9. Cell Biosci. 5, 15 (2015).
- Jaffe, K. M., et al. c21orf59/kurly Controls Both Cilia Motility and Polarization. Cell Rep. 14 (8), 1841-1849 (2016).
- Liu, Z., et al. Efficient genome editing of genes involved in neural crest development using the CRISPR/Cas9 system in Xenopus embryos. Cell Biosci. 6, 22 (2016).
- Naert, T., et al. CRISPR/Cas9 mediated knockout of rb1 and rbl1 leads to rapid and penetrant retinoblastoma development in Xenopus tropicalis. Sci Rep. 6 (35264), (2016).
- Ratzan, W., Falco, R., Salanga, C., Salanga, M., Horb, M. E. Generation of a Xenopus laevis F1 albino J strain by genome editing and oocyte host-transfer. Dev Biol. 426 (2), (2016).
- Bhattacharya, D., Marfo, C. A., Li, D., Lane, M., Khokha, M. K. CRISPR/Cas9: An inexpensive, efficient loss of function tool to screen human disease genes in Xenopus. Dev Biol. 408 (2), 196-204 (2015).
- Shigeta, M., et al. Rapid and efficient analysis of gene function using CRISPR-Cas9 in Xenopus tropicalis founders. Genes Cells. 21 (7), 755-771 (2016).
- Hontelez, S., et al. Embryonic transcription is controlled by maternally defined chromatin state. Nat Commun. 6, 10148 (2015).
- Peshkin, L., et al. On the Relationship of Protein and mRNA Dynamics in Vertebrate Embryonic Development. Dev Cell. 35 (3), 383-394 (2015).
- Owens, N. D., et al. Measuring Absolute RNA Copy Numbers at High Temporal Resolution Reveals Transcriptome Kinetics in Development. Cell Rep. 14 (3), 632-647 (2016).
- Blitz, I. L., Fish, M. B., Cho, K. W. Leapfrogging: primordial germ cell transplantation permits recovery of CRISPR/Cas9-induced mutations in essential genes. Development. 143 (15), 2868-2875 (2016).
- Blackler, A. W. Transfer of germ-cells in Xenopus laevis. Nature. 185, 859-860 (1960).
- Blackler, A. W., Fischberg, M. Transfer of primordial germ-cells in Xenopus laevis. J Embryol. Exp Morph. 9, 634-641 (1961).
- Bounoure, L. . L’origine des cellules reproductrices et le problem de la lignee germinale. , (1939).
- Nieuwkoop, P. D., Sutasurya, L. A. . Primordial Germ Cells in the Chordates: Embryogenesis and phylogenesis. , (1979).
- Heasman, J., Holwill, S., Wylie, C. C. Fertilization of cultured Xenopus oocytes and use in studies of maternally inherited molecules. Methods Cell Biol. 36, 213-230 (1991).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Embryo dissection and micromanipulation tools. CSH Protoc. , (2007).
- Nakayama, T., et al. Cas9-based genome editing in Xenopus tropicalis. Methods Enzymol. 546, 355-375 (2014).
- Ogino, H., McConnell, W. B., Grainger, R. M. High-throughput transgenesis in Xenopus using I-SceI meganuclease. Nat Protoc. 1 (4), 1703-1710 (2006).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. . Early development of Xenopus laevis.: a laboratory manual. , (2000).
- Kay, B. K., Kay, B. K., Peng, H. B. Injection of oocytes and embryos. Xenopus laevis: Practical Uses in Cell and Molecular Biology (Methods in Cell Biology Vol. 36). , (1991).
- Nieuwkoop, P., Faber, J. . Normal Table of Xenopus laevis. (Daudin): A Systematical and Chronological Survey of the Development from the Fertilized Egg till the End of Metomorphosis. , (1994).
- Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition. Nucleic Acids Res. 42 (22), e168 (2014).
- Sander, V., Reversade, B., De Robertis, E. M. The opposing homeobox genes Goosecoid and Vent1/2 self-regulate Xenopus patterning. EMBO J. 26 (12), 2955-2965 (2007).
- Bedell, V. M., et al. In vivo genome editing using a high-efficiency TALEN system. Nature. 491 (7422), 114-118 (2012).
- Kim, J. M., Kim, D., Kim, S., Kim, J. S. Genotyping with CRISPR-Cas-derived RNA-guided endonucleases. Nat Commun. 5, 3157 (2014).
- Kim, H. J., Lee, H. J., Kim, H., Cho, S. W., Kim, J. S. Targeted genome editing in human cells with zinc finger nucleases constructed via modular assembly. Genome Res. 19 (7), 1279-1288 (2009).
- Qiu, P., Shandilya, H., D’Alessio, J. M., O’Connor, K., Durocher, J., Gerard, G. F. Mutation detection using Surveyor nuclease. Biotechniques. 36 (4), 702-707 (2004).
- Ota, S., et al. Efficient identification of TALEN-mediated genome modifications using heteroduplex mobility assays. Genes Cells. 18 (6), 450-458 (2013).
- Dahlem, T. J., et al. Simple Methods for Generating and Detecting Locus- Specific Mutations Induced with TALENs in the Zebrafish Genome. PLoS Genet. 8 (8), e1002861 (2012).
- Ramlee, M. K., Yan, T., Cheung, A. M., Chuah, C. T., Li, S. High-throughput genotyping of CRISPR/Cas9-mediated mutants using fluorescent PCR-capillary gel electrophoresis. Sci Rep. 5, 15587 (2015).
- Bhattacharya, D., Marfo, C. A., Li, D., Lane, M., Khokha, M. K. CRISPR/Cas9: An inexpensive, efficient loss of function tool to screen human disease genes in Xenopus. Dev Biol. 408 (2), 196-204 (2015).
- Yu, C., Zhang, Y., Yao, S., Wei, Y. A PCR Based Protocol for Detecting Indel Mutations Induced by TALENs and CRISPR/Cas9 in Zebrafish. PLoS ONE. 9 (6), e98282 (2014).
- Mock, U., Hauber, I., Fehse, B. Digital PCR to assess gene-editing frequencies (GEF-dPCR) mediated by designer nucleases. Nat Protoc. 11 (3), 598-615 (2016).
- Varshney, G. K., et al. High-throughput gene targeting and phenotyping in zebrafish using CRISPR/Cas9. Genome Res. 25 (7), 1030-1042 (2015).
- Shi, J., Wang, E., Milazzo, J. P., Wang, Z., Kinney, J. B., Vakoc, C. R. Discovery of cancer drug targets by CRISPR-Cas9 screening of protein domains. Nat Biotechnol. 33 (6), 661-667 (2015).
- Koebernick, K., Loeber, J., Arthur, P. K., Tarbashevich, K., Pieler, T. Elr-type proteins protect Xenopus Dead end mRNA from miR-18-mediated clearance in the soma. Proc Natl Acad Sci USA. 107, 16148-16153 (2010).
- Yang, J., Aguero, T., King, M. L. The Xenopus maternal-to-zygotic transition from the perspective of the germline. Curr Top Dev Biol. 113, 271-303 (2015).
