Trasplante de células de germen primordiales para basada en CRISPR/Cas9 Leapfrogging en Xenopus
Summary
Genes esenciales para la supervivencia de plantean obstáculos técnicos para la creación de líneas mutantes. Leapfrogging evita mortalidad combinando genoma corrige con el trasplante de células de germen primordiales para crear tipo de salvaje animales portadores de mutaciones del germline. Evitamos también permite la generación eficiente de homocigotos mutantes nulos en la generación de1 F. Aquí, se demuestra el paso del trasplante.
Abstract
La creación de líneas mutantes por la edición del genoma está acelerando el análisis genético de muchos organismos. CRISPR/Cas9 métodos han sido adaptados para su uso en la rana con garras africana, Xenopus, un organismo modelo de larga data para investigación biomédica. Esquemas tradicionales para la creación de líneas homocigóticas mutantes con mutagénesis CRISPR/Cas9-objetivo tienen varios pasos lentos y laboriosos. Para facilitar la creación de embriones mutantes, particularmente para superar los obstáculos asociados a la anulación de los genes que son esenciales para la embriogénesis, se desarrolló un nuevo método llamado leapfrogging. Esta técnica aprovecha la solidez de Xenopus embriones para “cortar y pegar” métodos embriológicos. Leapfrogging utiliza a la transferencia de células de germen primordiales (PGCs) de embriones de donante mutagenized eficientemente en ablación de PGC wildtype hermanos. Este método permite la eficiente mutación de genes esenciales creando animales quiméricos con células somáticas de tipo salvaje que llevan un mutante del germline. Cuando dos animales de0 F portadores de “saltarse los trasplantes” (es decir, células de germen mutante) se cruzan, producen homocigóticos o compuestos heterozigóticos, nulos F1 embriones, ahorrando así un tiempo de toda una generación para obtener datos fenotípicos. Evitamos también proporciona un nuevo enfoque para el análisis de genes de efecto materno, que son refractarios a F0 fenotípica análisis CRISPR/Cas9 mutagénesis. Este manuscrito detalla el método de leapfrogging, con especial énfasis en cómo realizar con éxito trasplantes de PGC.
Introduction
Genotipo codifica el fenotipo ha sido una cuestión importante en la biología desde el redescubrimiento de las leyes de Mendel. Una comprensión de las funciones de los genes, su Reglamento y las interacciones en las redes de genes y las funciones de las promesas de productos codificados para proporcionar herramientas para descubrir nueva biología y mejorando Estados de enfermedad. Para más de la mitad del siglo1, la rana africana con garras, Xenopus, ha sido un líder modelo para estudios sobre una amplia variedad de temas en biología fundamental y biomedicina, incluyendo el control genético del desarrollo. Históricamente, la investigación en Xenopus ha utilizado la rana tetraploide, X. laevis, pero más recientemente, debido a su Diploidia, X. tropicalis ha sido desarrollado como un modelo genético de anfibios. Se han reunido las secuencias completas del genoma de ambas especies de Xenopus 2,3. La “comunidad de rana” está ahora en un punto de inflexión donde tecnología de la modificación básica del genoma permite el estudio de la función del gene, prácticamente a voluntad. Endonucleasas CRISPR/Cas9 programables han hecho que la mutagénesis de genes altamente eficientes, con mutación de biallelic posible en la mayoría de las células de los animales4,5,6,7, 8,9,10,11. Estos estudios, puesto de relieve por Bhattacharya et al. 12 y Shigeta et al. 13, han demostrado que la función de muchos genes puede estudiarse mediante mutagénesis en animales de mosaico F0 . Este enfoque tiene muchas ventajas; sin embargo, los embriones microinyectados Cas9-sgRNA a menudo Mostrar fenotipos variables debido a la incompleta pérdida de la función (LOF). Más significativamente, la generación de líneas mutantes es altamente ventajosa para algunas aplicaciones, en particular, al estudiar los genes que tienen una contribución materna del mRNA. Materna mRNAs y proteínas y sus influencias en la epigenética, persisten durante un período prolongado en embriogénesis14,15,16, haciendo las aportaciones del desarrollo tempranas de muchos genes refractario a los análisis de0 F. Por lo tanto, se necesitan otros enfoques LOF.
A la hora crear líneas mutantes, el camino a la obtención de embriones homocigóticos de LOF tiene varios obstáculos. Mutagénesis en primer lugar, eficiente para producir mutaciones biallelic puede ser una desventaja debido a pérdida de las funciones del gen esencial en el fracaso para sobrevivir hasta la madurez sexual, interfiriendo con la producción de una línea viable. Una solución común es la valoración cuidadosa de la cantidad de Cas9-sgRNA entregado. Aquí, el objetivo es lograr un equilibrio entre la reducción de la mortalidad mientras que también maximiza la eficiencia de mutagénesis del germline. Un segundo problema surge a partir del esquema de cría estándar, donde análisis fenotípicos se difieren hasta la generación de2 F. Utilizando el enfoque estándar, maduran sexualmente animales de0 F que transmiten a mutante alleles a través de la línea germinal son cruzadas para producir F1 heterocigoto “portadores”, que luego crecen hasta la madurez sexual. Dos heterocigotos1 de F entonces se entrecruzan para producir embriones mutantes de F2 a una frecuencia mendeliana esperada del 25%. Así, dos generaciones de cría son necesarias para el análisis de los fenotipos mutantes. Animales mutantes podrían ser homocigotos o heterocigotos compuestos (es decir, progenie que contiene dos diferentes alelos del mutante, que depende de los genotipos de los padres animales utilizados en los intercross de1 F).
Estos obstáculos pueden superarse por confinamiento programable mutagénesis mediada por la nucleasa a las células de germen, que es la base de un nuevo método llamado saltar17. Leapfrogging tiene dos componentes principales: (1) la microinyección de mRNA Cas junto con sgRNA o nucleasa-sgRNA complejos (o de las nucleasas de dedos de principio, TALENs o zinc) en la etapa unicelular a eficientemente mutagenize genoma embrionario, seguido por (2) el trasplante de PGCs en embriones de tipo salvaje hermano, donde se eliminaron las PGCs endógenas. Puede obtenerse cuando ambos pasos son reemplazo del germline eficiente, completo con las células de germen mutantes. Blackler demostró en la década de 1960 que Xenopus PGCs podrían trasplantarse entre embriones con la neurula tarde y temprano tailbud etapas18,19. Para leapfrogging, enfoque de Blackler fue modificada mediante la realización de los trasplantes en el blastula etapa17, cuando PGCs se localizan en el polo vegetal del embrión20,21. Trasplante antes de la gastrulación tiene dos ventajas principales. En primer lugar, el engraftment de trasplantes y el posterior desarrollo normal fue encontrado para ser más eficiente cuando el trasplante se realiza en la fase de blástula (observaciones no publicadas). En segundo lugar, realizando trasplantes de blastula etapa poco después transcripción cigóticos ha comenzado, uno puede evitar la letalidad resultantes del desarrollo gene mutaciones que afecten la gastrulación u originar malformaciones neurulae finales. PGC trasplante-cojinete (“saltaba”) embriones son cultivados a la madurez sexual, y intercrosses entre estos F0 de animales han demostrado que, en muchos casos, 100% de la progenie de1 F muestran el fenotipo LOF (la mayoría siendo compuesto los heterocigotos), indicando la sustitución completa del germline con mutaciones específicas.
Se espera que evitamos acelerará enfoques genéticos en Xenopus. Evitamos también proporciona una alternativa al método de “transferencia de acogida”22 para el análisis de genes de efecto materno (observaciones no publicadas) de LOF. En la publicación actual, se presenta una descripción detallada del método, centrándose especialmente en el trasplante del PGC, en X. tropicalis (con pequeñas modificaciones para X. laevis). El trasplante de PGCs se demuestra aquí para facilitar a una transferencia más rápida de esta tecnología a otros laboratorios que trabajan con Xenopus. Los principios de este método deben ser exitosos en otros anfibios (e.g., tritones), y específicas del organismo modificaciones en la metodología deben permitir para el uso de muchos otros animales en el que se puede lograr eficiente mutagénesis y PGCs son fácilmente transplantables.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este informe proporciona un protocolo detallado para el trasplante de tejido vegetal que contiene PGCs. trasplante de PGCs se utiliza en conjunción con las tecnologías de la edición del genoma (por ejemplo, CRISPR/Cas9) para modificar la línea germinal de un animal mientras mantenimiento de casi todos los tejidos somáticos como genéticamente tipo salvaje. Para evitamos para tener éxito, hay una serie de factores críticos a tener en cuenta antes de realizar realizar trasplantes.
<p class="jove_content…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue realizado con el apoyo de una beca, 5R21HD080684-02, del Instituto Nacional de salud infantil y desarrollo humano. El autor desea dar las gracias a Ken Cho por su constante entusiasmo y apoyo. El autor agradece también a Bruce Blumberg para uso de su cámara, Rebeca Charney, para la lectura crítica del manuscrito y Sean McNamara y Marcin Wlizla en el recurso nacional de Xenopus (RRID:SCR_013731), por la valiosa conversaciones sobre X. tropicalis de alimentación y los regímenes de cuidado de los animales.
Materials
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11252-20 or 11252-30 | |
| Eyebrow hair knife | Homemade | ||
| Hair loop | Homemade | ||
| Pasteur pipettes, borosilicate glass | Fisher Scientific | 13-678-20A | |
| Krazy Glue (Cyanoacrylate-based) | Elmer's Products, Inc. | KG581 | To affix eyebrow hair and hair loops into Pasteur pipettes, other similar glues can be used. |
| Oligodeoxynucleotides, custom ordered | Integrated DNA Technologies | Custom ordered | Template oligos for sgRNA synthesis, see Nakayama et al., 2014 for design details. |
| Megascript T7 kit | Ambion/ThermoFisher | AM1334 | Or use Megashortscript T7 (AM1354) kit |
| Phenol, Tris buffered | High quality distilled phenol from any commercial supplier | ||
| Chloroform | High quality chloroform from any commercial supplier | ||
| Ethanol | High quality ethanol from any commercial supplier | ||
| Diethylpyrocarbonate (DEPC) | Sigma Chemical Co. | D5758-50ML | |
| Cas9 protein, with nuclear localization signal | PNA Bio, Inc. | CP01 | Reconstituted using DEPC-treated water according to manufacturer's recommendations |
| 10X Marc's Modified Ringers solution | Homemade. Recipe (ref 26) for 1X MMR (lacking EDTA) is 100mM NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 5 mM HEPES. Solution is pH adjusted to 7.4. | ||
| Agarose | Any Molecular Biology grade agarose is sufficient | ||
| 60 X15 mm Petri plates | Falcon | 351007 | |
| 24-well plates | Falcon | 3047 | |
| L-Cysteine | Sigma Chemical Co. | C7352-100G | Free base, not HCl salt |
| Proteinase K | Roche | 03 115 828 001 | Typically ~20mg/ml from Roche |
| sera Micron | sera | Tadpole food. Resuspend in growth medium. Can be purchased from a variety of online retailers |
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