للواسمات Spermatogonia الزرد بأكملها الخصيتين إبرة مغمورة تبريد فائقة السرعة
Summary
وكان الغرض الرئيسي من هذه الدراسة التكيف مع الإبرة مغمورة الداخلي التزجيج (يقول:) كريوبريسيرفي الخصيتين الزرد كله. بالإضافة إلى ذلك، تم اختبار التكرار الأسلوب في خمس سلالات مختلفة الزرد.
Abstract
الاتجاهات الحالية في مجال العلم والتكنولوجيا الحيوية يؤدي إلى خلق الآلاف من خطوط جديدة في نموذج الكائنات الحية مما يؤدي إلى ضرورة اتباع أساليب جديدة للتخزين الأمن للموارد الجينية خارج الممارسات المشتركة للحفاظ على تكاثر المستعمرات. وكان الغرض الرئيسي من هذه الدراسة التكيف مع الإبرة مغمورة الداخلي التزجيج (يقول:) كريوبريسيرفي الخصيتين الزرد كله. تجميد الخلايا الجرثومية في مرحلة مبكرة من الخصيتين كله يقول: يوفر إمكانيات لتخزين الزرد الموارد الجينية، وخصوصا بعد زرع الأعضاء أنهم يمكن أن تنضج في الأمشاج الذكور والإناث على حد سواء. وقد اقتطعت الخصيتين، معلقة على إبرة الوخز بالإبر، اكويليبراتيد في اثنين من وسائط الإعلام كريوبروتيكتيفي (الحل الموازنة التي تحتوي على الميثانول 1.5 متر و 1.5 متر البروبيلين غليكول؛ والحل التزجيج المحتوية على م 3 ثنائي ميثيل سلفوكسيد و 3 م البروبيلين غليكول) وانخفضت إلى النيتروجين السائل. وقد استعد عينات في سلسلة من ثلاثة حلول الاحترار ما يترتب عليها. المزايا الرئيسية لهذه التقنية هي (1) عدم وجود المني بعد الهضم من حرارة الخصيتين مما يسهل التلاعب المتلقين للمعلومات؛ (2) فائقة السرعة التبريد تمكين الأمثل تعرض الأنسجة للنتروجين السائل ولتعظيم التبريد وخفض تركيز المطلوبة المنتجة، مما يقلل من سميتها؛ (3) متزامن تعرض الخصيتين عدة للمنتجة والنتروجين السائل؛ والتكرار (4) يتبين من الحصول على صلاحية فوق 50 في المائة في خمس سلالات مختلفة الزرد.
Introduction
الاتجاهات الجديدة في مجال العلم والتكنولوجيا الحيوية أدت إلى خلق آلاف خطوط جديدة متحولة من الفئران و المورفولوجية، الزرد وغيرها من الأنواع التي تستخدم كنموذج الكائنات الحية في الطب الحيوي و العلوم الأخرى1. وعلاوة على ذلك، كما يتم تطوير التكنولوجيات الجديدة وتصبح متاحة، أرقام الأسطر متحولة اطراد زيادة2. وهذا يؤدي إلى ضرورة لتخزين آمنة للموارد الجينية خارج الممارسات المشتركة للحفاظ على تكاثر المستعمرات. للواسمات كأسلوب التي يمكن تخزينها في مكان أمن للموارد الجينية لفترة غير محددة من الوقت، يوفر مزايا عديدة مثل تمديد الموسم الإنجابية، تلتف الحاجة إلى صيانة مستمرة للأمهات، وهو أكثر تكلفة–و 2من كفاءة العمل.
بروتوكولات لتجميد الحيوانات المنوية خلال مدى عدة سنوات2،3،4 فرصة لنجاح تخزين المواد الوراثية الذكور الزرد. ومع ذلك، نعد من البيض أو الأجنة في الأسماك لم يتم ممكناً بفضل بنيتها المعقدة وكميات كبيرة من مادة الصفار. في الآونة الأخيرة، يقدم ممارسة زرع الخلايا الجرثومية الأساسية (بجكس) أو الخلايا الجذعية سبيرماتوجونيال (SSCs) تجاوز لهذا الحاجز بتطوير وظيفي الحيوانات المنوية والبيض بعد زرع5. ولذلك، يقدم للواسمات SSCs أفقاً جديداً في حفظ الموارد الوراثية النادرة والقيمة.
على الرغم من أن نعد يوفر العديد من المزايا، بمعدل بطيء عملية تجميد يولد العديد من الشروط التي قد تؤدي إلى تلف الخلية2. وهذه تشمل تشكيل الجليد داخل الخلية وخارج الخلية، والجفاف، وسمية كريوبروتيكتانت وغيرها. أضرار الجليد داخل الخلية الخلايا، والجليد خارج الخلية قد يؤدي إلى سحق الميكانيكية للخلايا، في حين نشر المياه من الخلايا خلال معدل بطيء التجميد قد يؤدي إلى الجفاف6. في الآونة الأخيرة، تم تطبيق التزجيج كأسلوب الذي يمنع الآثار السلبية لتشكيل الجليد في تجميد الأسماك الأمشاج7،،من89. وهو يقدم أسلوب تبريد سريع جداً من خلالها تتحول وسائل الإعلام الداخلية والخارجية لدولة غير متبلور/زجاجي دون كريستاليزينج في الجليد7،10. وقد تجلى التزجيج ناجحة من أنسجة الخصية والمبيض في أنواع الطيور والثدييات10،11،12، مما فتح إمكانيات لتطبيقه في الأسماك، وكذلك.
في هذه الدراسة، نقدم الإجراء التزجيج (يقول:) إبرة مغمورة لنعد الخصيتين الزرد كله. علينا أن نظهر طريقة موثوقة لعزل الخلايا الجرثومية في مرحلة مبكرة الزرد دون التلوث وعملية تجميد أن ينتج كميات عالية نسبيا من الخلايا الجرثومية في مرحلة مبكرة مع وجود انخفاض للخلايا الأخرى، لا سيما من المني. على حد علمنا، هذا هو أول دراسة لإثبات بروتوكول تصور مفصل للتبريد السريع جداً للأسماك جوندال الأنسجة والخلايا germline الزرد. بالإضافة إلى ذلك، يظهر التكرار للأسلوب في خمس سلالات مختلفة الزرد: AB البرية نوع، كاسبر (روي–/–؛ الصدف-/-،) ليوبارد (ليوt1/t1) وفأسا [تيراغرام (vas::eGFP)] و Wilms الورم [تيراغرام (wt1b::eGFP 1)] خط المحورة وراثيا.
Protocol
Representative Results
Discussion
وكان الغرض الرئيسي من هذه الدراسة التكيف مع الإبرة مغمورة الداخلي تبريد فائقة السرعة لأنواع الطيور والثدييات10،11،12 إلى تجميد الأسماك الخصية (الزرد كنموذج الكائن الحي). معظم الدراسات السابقة فيما يتعلق بتجميد الموارد الوراثية الزرد كانت …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيده هذه الدراسة الوطنية للبحوث والتنمية والابتكار مكتب لهنغاريا (منحة 116912 ÁH)، مكتب التكلفة (الأغذية والزراعة تكلفة العمل FA1205: أكواجاميتي)، هونجاريكوم ستيبينديوم وبرنامج المنح الدراسية (المنح إلى ZM) والجديد المجرية الوطنية التميز بريدوكتورال زمالة (منحة كرونة إستونية).
Materials
| Leibovitz media (L-15) | Sigma-Aldrich | L1518 | Supplemented with L-glutamine |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F9665 | |
| Tricaine methanesulfonate (MS-222) | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Sucrose | Acros Organics | 57-50-1 | |
| Trehalose | Acros Organics | 99-20-7 | Dihydrate |
| Methanol | Reanal | 20740-0-08-65 | |
| Propylene glycol | Reanal | 08860-1-08-65 | |
| Dimethyl sulfoxide | Reanal | 00190-1-01-65 | |
| Collagenase | Gibco | 9001-12-1 | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T8003 | |
| DNase I | Panreac AppliChem | A3778 | |
| Trypan blue | Sigma-Aldrich | T6146 | |
| Phospate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P4417 | Tablets for preparation of 200 ml PBS solution |
References
- Mazur, P., Leibo, S. P., Seidel, G. R. J. Cryopreservation of the germplasm of animals used in biological and medical research: Importance, impact, status, and future directions. Biol. Reprod. 78 (1), 2-12 (2008).
- Carmichael, C., Westerfield, M., Varga, Z. M. Cryopreservation and In Vitro Fertilization at the Zebrafish International Resource Center. Methods Mol. Biol. 546, 45-65 (2009).
- Yang, H., Carmichael, C., Varga, Z. M., Tiersch, T. R. Development of a simplified and standardized protocol with potential for high-throughput for sperm cryopreservation in zebrafish Danio rerio. Theriogenology. 68 (2), 128-136 (2007).
- Morris, J. P., Berghmans, S., Zahrieh, D., Neuberg, D. S., Kanki, J. P., Look, A. T. Zebrafish sperm cryopreservation with N,N-dimethylacetamide. Biotechniques. 35 (5), 956-968 (2003).
- Yoshizaki, G., et al. Spermatogonial transplantation in fish: A novel method for the preservation of genetic resources. Comp. Biochem. Physiol. Part D: Genomics Proteomics. 6 (1), 55-61 (2011).
- Gao, D., Critser, J. K. Mechanisms of cryoinjury in living cells. ILAR J. 41 (4), 187-196 (2000).
- Asturiano, J. F., Cabrita, E., Horváth, &. #. 1. 9. 3. ;. Progress, challenges and perspectives on fish gamete cryopreservation: A mini-review. Gen. Comp. Endocrinol. 245, 69-76 (2017).
- Kása, E., et al. Development of sperm vitrification protocols for freshwater fish (Eurasian perch, Perca fluviatilis) and marine fish (European eel, Anguilla anguilla). Gen. Comp. Endocrinol. 245, 102-107 (2017).
- Cuevas-Uribe, R., Leibo, S. P., Daly, J., Tiersch, T. R. Production of channel catfish with sperm cryopreserved by rapid non-equilibrium cooling. Cryobiology. 63 (3), 186-197 (2011).
- Wang, Y., Xiao, Z., Li, L., Fan, W., Li, S. W. Novel needle immersed vitrification: A practical and convenient method with potential advantages in mouse and human ovarian tissue cryopreservation. Hum. Reprod. 23 (10), 2256-2265 (2008).
- Liu, J., Cheng, K. M., Silversides, F. G. Production of Live Offspring from Testicular Tissue Cryopreserved by Vitrification Procedures in Japanese Quail (Coturnix japonica). Biol. Reprod. 88 (5), 124 (2013).
- Liu, J., Cheng, K. M., Silversides, F. G. Novel needle-in-straw vitrification can effectively preserve the follicle morphology, viability, and vascularization of ovarian tissue in Japanese quail (Coturnix japonica). Anim. Reprod. Sci. 134 (3-4), 197-202 (2012).
- Lee, S., Yoshizaki, G. Successful cryopreservation of spermatogonia in critically endangered Manchurian trout (Brachymystax lenok). Cryobiology. 72 (2), 165-168 (2016).
- Marques, L. S., et al. Viability of zebrafish (Danio rerio) ovarian follicles after vitrification in a metal container. Cryobiology. 71 (3), 367-373 (2015).
- Lujić, J., et al. First successful vitrification of salmonid ovarian tissue. Cryobiology. 76, 154-157 (2017).
- Bono-Mestre, C., Cardona-Costa, J., García-Ximénez, F. Effects on cell viability of three zebrafish testicular cell or tissue cryopreservation methods. CryoLetters. 30 (2), 148-152 (2009).
- Marinović, Z., et al. Cryosurvival of isolated testicular cells and testicular tissue of tench Tinca tinca and goldfish Carassius auratus following slow-rate freezing. Gen. Comp. Endocrinol. 245, 77-83 (2017).
- Pšenička, M., Saito, T., Rodina, M., Dzyuba, B. Cryopreservation of early stage Siberian sturgeon Acipenser baerii germ cells, comparison of whole tissue and dissociated cells. Cryobiology. 72, 119-122 (2016).
- Lee, S., Iwasaki, Y., Shikina, S., Yoshizaki, G. Generation of functional eggs and sperm from cryopreserved whole testes. Proc. Nati. Acad. Sci. USA. 110 (5), 1640-1645 (2013).
