Crioconservazione degli spermatogoni di Zebrafish dall'intero testicoli ago immerso di raffreddamento ultra-rapido
Summary
Lo scopo principale di questo studio era di adattare l’ago immerso procedura di vitrificazione (NIV) per crioconservare intero zebrafish testicoli. Inoltre, è stata testata la ripetibilità del metodo in cinque zebrafish diversi ceppi.
Abstract
Attuali tendenze nella scienza e nella biotecnologia portano alla creazione di migliaia di nuove linee in organismi modello, determinando così la necessità di nuovi metodi per la conservazione delle risorse genetiche oltre le comuni pratiche di mantenere colonie riproduttive. Lo scopo principale di questo studio era di adattare l’ago immerso procedura di vitrificazione (NIV) per crioconservare intero zebrafish testicoli. Crioconservazione delle cellule di germe iniziale di testicoli interi NIV offre possibilità per lo stoccaggio di zebrafish risorse genetiche, soprattutto perché dopo il trapianto può maturare in gameti maschili e femminili. Testicoli sono stati asportati, appuntato su un ago di agopuntura, equilibrato in due mezzi di Crioprotettivi (soluzione di equilibrazione contenente metanolo di 1,5 M e 1,5 M glicole propilenico; e soluzione di vitrificazione contenente dimetilsolfossido di 3 M e 3 M glicole propilenico) e ‘ immerso in azoto liquido. I campioni venivano riscaldati in una serie di tre soluzioni di riscaldamento conseguente. I principali vantaggi di questa tecnica sono (1) la mancanza di spermatozoi dopo digestione dei testicoli riscaldati, facilitando così le manipolazioni a valle; (2) ultra-rapido raffreddamento che permette l’esposizione ottima dei tessuti a azoto liquido quindi massimizzare il raffreddamento e ridurre la concentrazione necessaria di crioprotettori, riducendo la loro tossicità; (3) esposizione sincrono dei testicoli parecchie ai crioprotettori e azoto liquido; e ripetibilità (4) dimostra come ottenere redditività di oltre il 50% in cinque differenti zebrafish ceppi.
Introduction
Nuove tendenze nella scienza e nella biotecnologia hanno portato alla creazione di migliaia di nuove linee mutanti di topo, Drosophila, zebrafish e altre specie utilizzate come organismi modello in biomedica e altre scienze1. Inoltre, come nuove tecnologie vengono sviluppate e diventano disponibili, i numeri di linee mutanti costantemente aumentano2. Questo porta alla necessità per una conservazione sicura delle risorse genetiche oltre le comuni pratiche di mantenere colonie riproduttive. Come un metodo che consente l’archiviazione sicura delle risorse genetiche per un periodo di tempo indefinito, crioconservazione offre molti vantaggi come estensione della stagione riproduttiva, aggira la necessità per la manutenzione continua dei riproduttori, ed è più costo – e Labor-efficiente2.
Protocolli per la crioconservazione di spermatozoi sviluppato durante il passato parecchi anni2,3,4 offrono la possibilità di successo deposito di materiale genetico maschile di zebrafish. Tuttavia, la crioconservazione degli ovuli o embrioni di pesce non è ancora possibile grazie alla loro struttura complessa e di grandi quantità di materiale di tuorlo. Recentemente, la pratica del trapianto di cellule primordiali germinali (PGC) o cellule staminali spermatogoniali (SSCs) offre un bypass per questa barriera di svilupparsi dopo trapianto5in funzionali degli spermatozoi e uova. Crioconservazione delle CSS offre quindi una nuova frontiera nella conservazione delle risorse genetiche rare e preziose.
Anche se crioconservazione offre molti vantaggi, il processo di congelamento lento-tasso genera diverse condizioni che possono portare a cella danno2. Questi includono la formazione di ghiaccio intracellulare ed extracellulare, disidratazione, tossicità crioprotettore e altri. Ghiaccio intracellulare danneggia le cellule, ghiaccio extracellulare può portare a frantumazione meccanica delle cellule, mentre la diffusione dell’acqua dalle cellule durante il congelamento lento-tasso può condurre a disidratazione6. Recentemente, vetrificazione come una tecnica che impedisce gli effetti negativi della formazione di ghiaccio è stata applicata nella crioconservazione di gameti di pesce7,8,9. Esso presenta una tecnica di raffreddamento ultra-rapida attraverso il quale i mezzi di comunicazione interne ed esterne trasformare in uno stato amorfo/vetroso senza cristallizzazione in ghiaccio7,10. Vetrificazione successo del tessuto testicolare e ovarico è stata provata in specie di uccelli e mammiferi10,11,12, aprendo così la possibilità per la sua applicazione in pesce, pure.
In questo studio, presentiamo la procedura di vitrificazione (NIV) ago immerso per la crioconservazione di zebrafish tutta i testicoli. Dimostriamo un metodo affidabile per l’isolamento di cellule germinali di zebrafish fase iniziale senza contaminazione e un processo di crioconservazione che produce quantità elevate relativamente precoce delle cellule di germe con una bassa presenza di altre cellule, soprattutto gli spermatozoi. Al meglio della nostra conoscenza, questo è il primo studio a dimostrare un protocollo dettagliato visualizzato in quel momento per ultra-rapido raffreddamento del tessuto gonadico pesce e cellule germinali zebrafish. Inoltre, è evidenziato la ripetibilità del metodo in cinque differenti zebrafish ceppi: AB wild-type, casper (roy– / –; madreperla– / –), leopardo (leot1/t1), vasa [Tg (vas::eGFP)] e linea transgenica di Wilms tumore [Tg (wt1b::eGFP 1)].
Protocol
Representative Results
Discussion
Lo scopo principale di questo studio era di adattare l’ago immerso ultra-rapida procedura di raffreddamento sviluppato per specie di uccelli e mammiferi10,11,12 per la crioconservazione del testicolo di pesce (zebrafish come modello organismo). La maggior parte degli studi precedenti per quanto riguarda la crioconservazione delle risorse genetiche di zebrafish erano principalmente concentrata sulla crioconservazione di zebrafish…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo studio è stato sostenuto dai nazionali di ricerca, sviluppo e innovazione ufficio d’Ungheria (grant 116912 a MÀY), l’ufficio di costo (cibo e agricoltura costo azione FA1205: AQUAGAMETE), al programma di borse di Hungaricum Stipendium (grant a ZM) e il nuovo Hungarian National eccellenza Predoctoral Fellowship (grant a EK).
Materials
| Leibovitz media (L-15) | Sigma-Aldrich | L1518 | Supplemented with L-glutamine |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F9665 | |
| Tricaine methanesulfonate (MS-222) | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Sucrose | Acros Organics | 57-50-1 | |
| Trehalose | Acros Organics | 99-20-7 | Dihydrate |
| Methanol | Reanal | 20740-0-08-65 | |
| Propylene glycol | Reanal | 08860-1-08-65 | |
| Dimethyl sulfoxide | Reanal | 00190-1-01-65 | |
| Collagenase | Gibco | 9001-12-1 | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T8003 | |
| DNase I | Panreac AppliChem | A3778 | |
| Trypan blue | Sigma-Aldrich | T6146 | |
| Phospate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P4417 | Tablets for preparation of 200 ml PBS solution |
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