全体の睾丸針によるゼブラフィッシュを精原細胞の凍結保存に超急速冷却浸漬
Summary
本研究の主な目的は、針を合わせて全体のゼブラフィッシュ精巣を凍結保存するガラス (NIV) の手順を浸漬でした。さらに、5 つの異なるゼブラフィッシュ系統における法の再現性がテストされました。
Abstract
科学とバイオ テクノロジーの現在の傾向は、何千ものそれによって繁殖コロニーを維持する一般的なプラクティスを超える遺伝資源の安全な保管のための新しい方法の必要性につながるモデル有機体内の新しい行の作成に します。本研究の主な目的は、針を合わせて全体のゼブラフィッシュ精巣を凍結保存するガラス (NIV) の手順を浸漬でした。初期段階全体精巣生殖細胞の凍結保存わたしを楽しめ、ゼブラフィッシュの貯蔵のため遺伝資源移植後彼らは雄性と雌性の配偶子に成熟することができます特に以来。精巣を摘出、2 凍害メディア (1.5 M メタノールと 1.5 M プロピレング リコール; 平衡ソリューションと 3 M ジメチルスルホキシドと 3 M プロピレング リコールを含むガラス固化ソリューション) で平衡鍼灸針の固定液体窒素に墜落しました。サンプルは、3 つの結果として地球温暖化ソリューションのシリーズで暖められました。この手法の主な利点 (1) 精子の不足は、暖められた精巣のため下流の操作が容易の消化後(2) 超急速冷却液体窒素したがって冷却と凍結保護剤、その毒性を低減の必要濃度の削減を最大化する組織の最適な露出を有効にします。(いくつか精巣の凍結保護剤と液体窒素への露出 3) 同期(4) の再現性は 5 つの異なるゼブラフィッシュ系統で 50% 以上の生存率を得ることによって示されます。
Introduction
科学とバイオ テクノロジーの新しいトレンドは、マウスやショウジョウバエ、ゼブラフィッシュ モデル有機体生物医学的でおよび他の科学の1として使用される他種の新しい突然変異系統の何千もの作成につながっています。さらに、新技術の開発し、利用可能になるが、突然変異系統の数は着実に2を増加します。これの繁殖コロニーを維持する一般的な慣行を超えて遺伝資源の安全なストレージの必要性に します。凍結保存を不特定期間の遺伝資源の安全な保管を可能にする方法としては繁殖期の延長は親魚、継続的なメンテナンスの必要性を回避して、それはより多くのコスト-のように多くの利点を提供していて、労働効率2。
過去数年間2,3,4中に開発された精子凍結保存のためのプロトコルは、ゼブラフィッシュ男性遺伝物質の正常なストレージのための機会を提供しています。しかし、卵や魚の胚の凍結保存は、まだ彼らの複雑な構造と卵黄素材の大量のためことはできません。最近では、始原生殖細胞 (PGCs) 精原幹細胞 (Ssc) の移植の実践は機能的な精子や卵子に移植5後開発することによってこの障壁をバイパスをご利用いただけます。したがって、Ssc の凍結保存には、希少で貴重な遺伝資源の保全の新たなフロンティアが提供しています。
でも、凍結は、多くの利点を提供しています、緩速凍結過程は細胞損傷の2につながる可能性がありますいくつかの条件を生成します。細胞内および細胞外凍結、脱水、凍結毒性が挙げられます。細胞内氷被害、細胞、細胞外の氷は細胞から緩速凍結中の水の拡散は脱水6につながる可能性がありますしながら細胞の機械的粉砕する可能性があります。最近では、魚の配偶子7,8,9の凍結保存で氷形成の負の影響を防止する手法としてガラスを適用されています。それは、内部および外部のメディアに氷7,10に 0.28-0.5% なし/ガラスの非晶質状態に超急速冷却法を提示します。精巣や卵巣組織のガラス化を成功が証明されて鳥と哺乳類10、11,12、こうして魚、同様の応用の可能性を開きます。
本研究では全体のゼブラフィッシュ精巣の凍結保存用浸漬針ガラス (NIV) の手順を提案する.ゼブラフィッシュ初期生殖細胞汚染も初期生殖細胞の比較的高い金額を他の細胞、特に精子の低い存在を生み出すため凍結のプロセスを分離するための信頼性の高い方法を紹介します。我々 の知る限り、これは魚の生殖腺組織およびゼブラフィッシュ生殖細胞の超急速冷却のため詳細な可視化プロトコルを示す最初の研究。さらに、メソッドの再現性、5 つの異なるゼブラフィッシュ系統に示されて: AB 野生型、キャスパー (ロイ-/-;真珠-/-)、ヒョウ (レオt1/t1)、ヴァーサ号 [Tg (vas::eGFP)] ウィルムス腫瘍 [Tg (wt1b::eGFP 1)] 形質転換線。
Protocol
Representative Results
Discussion
本研究の主な目的は、針を適応する鳥類と哺乳類10、11,12魚の精巣 (モデルとしてのゼブラフィッシュの凍結保存するために開発された超高速冷却手順を浸漬生物)。ゼブラフィッシュ遺伝子資源の凍結保存に関する従来の研究のほとんどは、ゼブラフィッシュ精子2,3,<sup c…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
本研究は、国立の研究、開発および革新ハンガリー オフィス (ÁH にグラント 116912) 費用事務所に支えられ (食品と農業コスト アクション FA1205: AQUAGAMETE)、Stipendium Hungaricum 奨学金プログラム (ザンビアにグラント)、新ハンガリー国家卓越性また、博士課程フェローシップ (EK にグラント)。
Materials
| Leibovitz media (L-15) | Sigma-Aldrich | L1518 | Supplemented with L-glutamine |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F9665 | |
| Tricaine methanesulfonate (MS-222) | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Sucrose | Acros Organics | 57-50-1 | |
| Trehalose | Acros Organics | 99-20-7 | Dihydrate |
| Methanol | Reanal | 20740-0-08-65 | |
| Propylene glycol | Reanal | 08860-1-08-65 | |
| Dimethyl sulfoxide | Reanal | 00190-1-01-65 | |
| Collagenase | Gibco | 9001-12-1 | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T8003 | |
| DNase I | Panreac AppliChem | A3778 | |
| Trypan blue | Sigma-Aldrich | T6146 | |
| Phospate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P4417 | Tablets for preparation of 200 ml PBS solution |
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