Criopreservação de Zebrafish espermatogónias por toda agulha testículos imersos refrigeração ultra rápida
Summary
O principal objetivo deste estudo foi adaptar-se a agulha imerso procedimento de vitrificação (NVI) para cryopreserve toda zebrafish testículos. Além disso, a repetibilidade do método em cinco estirpes diferentes zebrafish foi testada.
Abstract
As tendências atuais na ciência e biotecnologia levam à criação de milhares de novas linhas em organismos-modelo, assim, levando à necessidade de novos métodos para o armazenamento seguro dos recursos genéticos, além de práticas comuns de manter colônias de reprodução. O principal objetivo deste estudo foi adaptar-se a agulha imerso procedimento de vitrificação (NVI) para cryopreserve toda zebrafish testículos. Criopreservação de células germinativas de fase inicial pelos testículos todo NIV oferece possibilidades para o armazenamento de zebrafish recursos genéticos, especialmente desde que após transplante eles podem amadurecer em gâmetas masculinas e femininas. Os testículos foram extirpados, preso em uma agulha de acupuntura, incubada em dois meios de cryoprotective (solução de equilibração contendo metanol de 1,5 M e 1,5 M propilenoglicol; e solução de vitrificação contendo o sulfoxide dimethyl 3M e 3M propileno glicol) e caiu em nitrogênio líquido. Amostras foram aquecidas em uma série de três soluções de aquecimento consequentes. As principais vantagens desta técnica são (1) a falta de espermatozoides após a digestão dos testículos aquecidos, facilitando assim a jusante manipulações; (2) ultra rápido resfriamento permitindo a exposição ideal dos tecidos ao nitrogênio líquido, portanto, maximizando o resfriamento e reduzindo a concentração necessária de crioprotectores, reduzindo assim a sua toxicidade; (3) síncrona exposição dos testículos vários crioprotectores e nitrogênio líquido; e (4) repetibilidade demonstrado pela obtenção de viabilidade de acima de 50% em cinco estirpes diferentes do zebrafish.
Introduction
Novas tendências na ciência e biotecnologia levaram à criação de milhares de novas linhas de mutantes de camundongos, drosófila, zebrafish e outras espécies utilizadas como organismos modelo em biomédicas e outras ciências1. Além disso, como novas tecnologias são desenvolvidas e se tornam disponíveis, os números das linhas mutantes constantemente aumentam2. Isto leva à necessidade para um armazenamento seguro dos recursos genéticos, além de práticas comuns de manter colônias de reprodução. Como um método que permite a armazenagem segura dos recursos genéticos por um período indefinido de tempo, criopreservação oferece muitas vantagens, tais como extensão da temporada reprodutiva, contorna a necessidade de manutenção contínua dos reprodutores, e é mais custo – e eficiência do trabalho2.
Protocolos de criopreservação de espermatozoides desenvolvidos durante os últimos vários anos2,3,4 oferecem a oportunidade para armazenamento bem sucedida do zebrafish material genético masculino. No entanto, criopreservação de ovos ou embriões de peixe ainda não é possível devido à sua estrutura complexa e grandes quantidades de material de gema. Recentemente, a prática do transplante de células germinativas primordiais (PGCs) ou células-tronco das espermatogónias (SSCs) oferece um desvio para essa barreira, desenvolvendo-se em ovos e esperma funcional após transplante5. Portanto, a criopreservação de SSCs oferece uma nova fronteira na conservação dos recursos genéticos raros e valiosos.
Apesar de criopreservação oferece muitas vantagens, o processo de congelação lenta-taxa gera várias condições que podem levar a célula danos2. Estes incluem a formação de gelo intracelular e extracelular, desidratação, toxicidade crioprotetoras e outros. Gelo intracelular danifica as células, gelo extracelular pode levar ao esmagamento mecânico das células, enquanto a difusão de água das células durante a lenta taxa de congelamento pode levar a desidratação6. Recentemente, foi aplicada na criopreservação de gâmetas de peixe a7,8,9vitrificação como uma técnica que previne os efeitos negativos da formação de gelo. Apresenta uma técnica de resfriamento ultra rápida através do qual os meios de comunicação internos e externos se transformar em um estado amorfo/vítreo sem reveladores em gelo7,10. Bem sucedida vitrificação de tecido ovariano e testicular tem sido evidenciada na espécie aviária e mamíferos10,11,12, abrindo assim as possibilidades de sua aplicação em peixes, também.
Neste estudo, apresentamos o processo de vitrificação (NVI) agulha imergido para a criopreservação de testículos de zebrafish toda. Vamos demonstrar um método confiável para o isolamento do zebrafish estágio inicial de pilhas de germe sem contaminação e um processo de criopreservação que produz relativamente grandes quantidades de células germinativas de fase inicial com uma baixa presença de outras células, especialmente de espermatozoides. O melhor de nosso conhecimento, este é o primeiro estudo a demonstrar um protocolo detalhado visualizado para refrigeração ultra rápida de tecido gonadal de peixe e as células da linha germinal do zebrafish. Além disso, a repetibilidade do método é demonstrada no cinco estirpes diferentes zebrafish: AB tipo selvagem, casper (roy– / –; nácar– / –), leopardo (leo,t1/t1), vasa [Tg (vas::eGFP)] e linha de transgénicos Wilms tumor [Tg (wt1b::eGFP 1)].
Protocol
Representative Results
Discussion
O principal objetivo deste estudo foi adaptar-se a agulha imerso ultra rápido refrigeração procedimento desenvolvido para espécies de mamíferos e aviária10,11,12 para a criopreservação do testículo de peixe (zebrafish como modelo organismo). A maioria dos estudos anteriores sobre criopreservação dos recursos genéticos de zebrafish concentraram-se principalmente na criopreservação de esperma de zebrafish<sup class="…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudo foi suportado pelo nacionais de investigação, desenvolvimento e inovação escritório da Hungria (grant 116912 ÁH), o escritório de custo (alimentação e agricultura custo ação FA1205: AQUAGAMETE), o programa de bolsas do Hungaricum (grant para ZM) e o novo Húngara nacional excelência Predoctoral Fellowship (grant Para EK).
Materials
| Leibovitz media (L-15) | Sigma-Aldrich | L1518 | Supplemented with L-glutamine |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F9665 | |
| Tricaine methanesulfonate (MS-222) | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Sucrose | Acros Organics | 57-50-1 | |
| Trehalose | Acros Organics | 99-20-7 | Dihydrate |
| Methanol | Reanal | 20740-0-08-65 | |
| Propylene glycol | Reanal | 08860-1-08-65 | |
| Dimethyl sulfoxide | Reanal | 00190-1-01-65 | |
| Collagenase | Gibco | 9001-12-1 | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T8003 | |
| DNase I | Panreac AppliChem | A3778 | |
| Trypan blue | Sigma-Aldrich | T6146 | |
| Phospate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P4417 | Tablets for preparation of 200 ml PBS solution |
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