Summary
Este protocolo apresenta uma abordagem para a análise do transcriptoma toda de zebrafish embriões, larvas, ou células de classificados. Nós incluímos o isolamento do RNA, análise de caminho de dados de RNASeq e validação de qRT-PCR-baseados de mudanças de expressão do gene.
Abstract
A análise das alterações de expressão do gene global é uma ferramenta valiosa para identificar novos caminhos subjacentes fenótipos observados. O peixe-zebra é um excelente modelo para avaliação rápida do transcriptoma toda de populações de células individuais ou todo animal devido à facilidade de isolamento do RNA de um grande número de animais. Aqui apresenta-se um protocolo para análise de expressão de gene global em embriões de peixe-zebra usando a sequenciação do ARN (RNASeq). Descrevemos a preparação do RNA de embriões de todo ou de populações de células obtidas usando célula de triagem em animais transgénicos. Também descrevemos uma abordagem para análise de dados RNASeq para identificar caminhos enriquecidos e termos de Gene Ontology (GO) em conjuntos de dados de expressão de gene global. Finalmente, nós fornecemos um protocolo para a validação das alterações de expressão do gene usando transcriptase reversa quantitativo PCR (qRT-PCR). Esses protocolos podem ser usados para análise comparativa de controle e experimental de moda de zebrafish para identificar alterações de expressão do gene de romance e fornecem a introspecção molecular de fenótipos de interesse.
Introduction
Análise comparativa da expressão gênica global é uma ferramenta valiosa para identificar novos genes, contribuindo para fenótipos observados. Tais análises normalmente contam com avaliação quantitativa da abundância de transcrição em comparação entre experimental e amostras de controlo. Abordagens específicas, tais como qRT-PCR são relativamente rápida e exata para investigação de alterações de expressão de gene único. A sequenciação do ARN (RNASeq) oferece uma abordagem ampla, livre de hipótese para identificar alterações significativas na expressão gênica entre as amostras, tornando-se agora o padrão para tais investigações através de sistemas experimentais.
Zebrafish têm emergido como um modelo de destaque em várias áreas da doença. Originalmente desenvolvido para sua utilidade em estudos de biologia do desenvolvimento, devido a sua alta fecundidade e relativamente baixo custo de manutenção, utilização experimental de zebrafish evoluiu para incluir uma ampla gama de fenótipos de embrionárias para estágios adultos, bem como um ampla gama de molecular ensaios1,2,3. Com efeito, estas vantagens fazem estudos moleculares mecanicistas rápida e econômica, devido à facilidade de adquirir grandes quantidades de material combinado com a facilidade de manipulação genética e ambiental em todas as fases da vida. Além disso, a natureza transparente de zebrafish embriões e larvas tornam ideal para a geração de linhas de transgénicos repórter células e tecidos específicos permitindo visualização na vivo de populações de células discretas4. Exploração de tais linhas permite a análise da expressão de gene global em tipos específicos de célula isolada baseados na expressão do gene repórter.
Aqui nós apresentamos um protocolo completo para análise de expressão do gene global usando o RNASeq após a cultura de embriões de peixe-zebra. Manipulações genéticas experimentais, incluindo Morpholinos (MO)-knockdown com base transitória do gene ou genoma mediada por CRISPR edição, foram apresentadas em outro lugar5,6,7. Nós, portanto, concentrar-se em um protocolo detalhado para isolamento de RNA de embriões todo ou classificados células transgénicas repórter-expressando seguidas por simples análise computacional de RNASeq resultados usando ferramentas de caminho e gene ontology (GO) termos. Finalmente, nós incluímos uma estratégia para a validação das alterações de expressão do gene por transcriptase reversa quantitativo PCR (qRT-PCR). Estes protocolos são aplicáveis aos embriões de zebrafish, sujeitados a uma ampla gama de condições experimentais, incluindo comparação de mutantes genéticos ou condições ambientais.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
todos os protocolos animais descritos abaixo estão em conformidade com e aprovado pela Universidade de Maryland institucional Animal Care e Comissão de utilização (IACUC).
1. preparação do embrião
- gerar embriões através de acasalamento natural
- embriões de cultura para 3 meses de idade, reprodutiva maturidade 5 , 8 .
- Separe peixes adultos masculinos e femininos da estirpe desejada em tanques de acasalamento divididos na noite antes da coleta de embrião e adicionar 2 machos e 3 fêmeas para cada tanque.
Nota: Uso da cepa transgênica insulin2a:mCherry fluorescente repórter permitiu a análise das células β-pancreáticas. - Transferência de peixes para o acasalamento do tanque com água fresca do sistema e remover o divisor imediatamente após as luzes acendem-se na manhã seguinte.
- Permitir que os peixes acasalar, naturalmente, até que os embriões são observados no reservatório inferior. Colete embriões em intervalos de 30 min até a quantidade desejada é coletada. Coletados de loja cada ponto do tempo em pratos de Petri separado em embriões em 28,5 ° C.
- Executar microinjection de material genético ou colocação em meios de cultura experimental 6, se desejado e cultura de embriões frescos Hank ' s embrião médio 8 em pratos de Petri de 10 cm a 28,5 ° C.
Nota: para a análise de expressão do gene em Morpholinos (MO) injetado ou animais mutantes, observe que cada manipulação pode ter impactos acidentais na expressão gênica. Mutantes podem apresentar compensação genética ao nível da transcrição que não foi observada pelo gene baseados em MO direcionamento 9.
- Estágio
- cultura de embriões em grupos de 50 – 75 embriões por prato de Petri de 10 cm para promover o sincronismo do desenvolvimento consistente de todos os embriões.
- Monitorar a morfologia do desenvolvimento usando microscópio dissecação em blastômero, epiboly e somite fases para garantir a progressão do desenvolvimento 10.
Nota: Remova qualquer moribundos ou malformados embriões para evitar o atraso de desenvolvimento no prato. - Separar os embriões baseados na idade do desenvolvimento. Medir a idade do embrião usando somite número após a segmentação (fertilização post pós-gastrulação, 10,33 h (hpf)) até aproximadamente 24 hpf. Encenar os embriões e larvas usando o comprimento total do corpo após 24 hpf.
Nota: As somitas são tecidos em forma de chevron mesodérmica presentes na parte dorsal do embrião. - Colocar os embriões classificados em uma incubadora de 28,5 ° C e permitir o desenvolvimento de progredir para a idade desejada.
2. Célula única dissociação: Todo embrião e classificada de populações de células
- dissociação todo embrião
- eutanásia os embriões de zebrafish na fase desejada, colocando o prato de Petri no gelo por 5-15 min, até que nenhum movimento é observado .
- Transferir uma piscina de 20 embriões para um tubo de microcentrifugadora rotulado de 1,5 mL. Remover qualquer excesso de embriões do tubo do microcentrifuge.
- Lise de adicionar 200 µ l de reagente (ver Tabela de materiais) para o tubo contendo embriões. Homogeneizar os embriões no reagente de Lise mecanicamente, utilizando um pilão. Adicione o reagente de Lise 800 µ l para trazer o volume total de 1 mL. Loja a-80 ° C até a extração do RNA.
- De isolamento da célula de fluxo-classificados 11
- transferir os embriões do prato de Petri em um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL e remover tanto médio de embrião possível.
Nota: Dependendo da idade do embrião, dissociação mecânica pode igualmente ser necessária neste passo. Com embriões > 48 hpf, recomendamos o uso de um pilão para romper a integridade do embrião antes de prosseguir. - Incubar os embriões com 1 mL de tampão de dissociação 1 (ver Tabela de materiais) no tubo de 1,5 mL microcentrifuge. Incube durante 15-30 min à temperatura ambiente. Triture a solução suavemente pipetando acima e para baixo usando uma dica P1000 para misturar a cada 3-4 min durante a etapa de incubação. FAZER não VORTEX.
- Recolher os embriões por centrifugação por 3 min a 300 x g e remover o sobrenadante. Re-suspenda os embriões em 1 mL de tampão de dissociação 2 (ver Tabela de materiais). Incubar durante 15-30 min à temperatura ambiente com trituração de pipeta regular.
- Avaliar a digestão diluindo-se 1-2 µ l da suspensão em fluorescência-ativado da pilha classificação Reserva (FACS) sob microscópio.
Nota: Digestão completa ocorreu quando a alíquota examinada mostra células únicas com clusters de célula mínima e pedaços de tecido embrionário. - Coletar as células por centrifugação a 300 x g, durante 5 min. remover sobrenadante. Ressuspender as células em 1 mL FACS buffer e filtro de gravidade através de um filtro de célula de 40 µm para remover o tecido não digerido da amostra.
- Contar as células usando um hemocytometer e diluir com tampão de FACS para aproximadamente 1 x 10 6 células/mL em um tubo de FACS.
Nota: Para os tipos de células com um número relativamente pequeno por embrião (menos de 5% do total), tais como células β-pancreáticas, usar um mínimo de 1.000 embriões estágio correspondente. - Fornecer os FACS classificação facilidade com o FACS tubos contendo 1 mL de amostras de suspensão de células, bem como o tubo de FACS contendo apenas os FACS Buffer ou reagente de Lise. Portão do fluxo FACS-classificador para coletar apenas única células que expressam o repórter fluorescente.
- Executar o fluxo FACS-classificação até o número de células desejado ter sido colhido.
Nota: Para executar RNASeq, há um mínimo necessário de RNA total. Encontramos que 3.000-5.000 células são suficientes para isolar a alta qualidade, alta concentração de RNA. - Armazenar as células coletadas no gelo e proceder de imediato à preparação do RNA.
- transferir os embriões do prato de Petri em um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL e remover tanto médio de embrião possível.
3. Preparação do RNA
- Extrair o RNA
- incubar a amostra coletada (da etapa 2) com o reagente de Lise por 5 min à temperatura ambiente.
- Adicionar 0,2 mL de clorofórmio para cada 1,0 mL de reagente de Lise usado e inverter os tubos à mão por 15 s. Incubar por 2-3 min à temperatura ambiente. Centrifugar as amostras a 12.000 x g por 15 min a 4 ° C.
- Transferir a fase aquosa, separada para um novo tubo e adicionar 0,5 mL de isopropanol para cada 1,0 mL de reagente de Lise usado. Incube durante 10 minutos à temperatura ambiente. Centrifugar as amostras a 12.000 x g por 10 min a 4 ° C.
- Lavagem com 75% de etanol e centrifugar as amostras a 7.500 x g por 5 min a 4 ° C. Retire o sobrenadante completamente e deixe secar à temperatura ambiente. Ressuspender o RNA em 15-30 µ l pyrocarbonate de dietilo (DEPC)-água tratada.
- Purify alta qualidade RNA
- combinar a suspensão de RNA com acetato de sódio 3M volume 1/10 (pH 5,5) e 1 volume de isopropanol. Incubar durante 20 min à temperatura ambiente e centrifugar as amostras a 12.500 x g por 10 minutos a 4 ° C.
- Lavar a pelota com etanol a 70% gelada na água tratada DEPC e centrifugar as amostras a 10.000 x g por 5 min a 4 ° C. repetir a etapa de lavagem uma vez.
- Remover o sobrenadante e deixar para secar à temperatura ambiente. Re-suspender em água tratada DEPC.
- Do ensaio o RNA extraído para a concentração (ng / µ l) e pureza (proporção de 260/230) usando um espectrômetro de absorção. Certifique-se de que o valor de 260/230 é ~ 2.0 antes de prosseguir com a RNASeq. Armazenar a-80 ° C até nose (até 6 meses).
- Enviar as amostras de RNA para um fornecedor ou núcleo para RNASeq e expressão gênica alterar análise com base na quantificação das leituras de sequenciamento. Os resultados retornados do fornecedor normalmente são fornecidos como uma lista de genes, exibindo uma dobra-mudança significativa na transcrição lê entre amostras.
Nota: Uma coluna pode ser usada se o método acima produz RNA de má qualidade. A quantidade, concentração e número de integridade de RNA (RIN) para amostras do RNA devem ser confirmadas com o fornecedor ou o núcleo. O fornecedor ou o núcleo avaliará também tipicamente RIN.
4. Percurso e análise do termo GO
Nota: consulte a Figura 1 para saída representativa da análise de expressão de gene após RNASeq fornecido pelo fornecedor ou núcleo.
- Sorting diferencialmente expressos genes
- comparando uma única condição experimental versus controle
- Abrir dados (resultados) em um software de gestão de folha de cálculo (ver tabela de materiais ).
- Marque a soltar Seta para baixo ao lado do ' tipo ' e seleccione " Custom tipo " dentro da planilha que contém os genes diferencialmente expressos no experimental versus condição controle.
- Marque a caixa em ' coluna ' na janela que aparece em cima e escolha classificar pelo ' LFC ' coluna. Certifique-se de ' valores ' é selecionado no ' tipo na ' coluna. Selecione esta opção para classificar do ' maior para o menor ' na ' ordem ' coluna e clique " Okey ".
Nota: Isto irá classificar os genes diferencialmente expressos, para que aqueles com expressão aumentada (LFC positivo) irão aparecer no topo da lista, enquanto aqueles com diminuição da expressão (LFC negativo) aparecerá na parte inferior da lista.
- Comparar as várias condições experimentais para um único controle da seguinte maneira.
- Selecione a primeira célula em uma coluna vazia no 1 Experimental contra a planilha de controle para determinar diferencialmente expressos genes encontrados em duas condições experimentais. Digite a seguinte equação para a célula:
Nota: esta equação é uma combinação de IF, ÉERROS e funções do jogo. (i) a função CORRESP, MATCH (A1, Experimental2_vs_Control! A:A, 0), irá procurar o valor em A1 (a ID de ENSEMBL) na coluna A (A:A) da planilha chamada Experimental2_vs_Control (Experimental2_vs_Control!). O " 0 " indica para procurar uma correspondência exata, e se for encontrada uma correspondência exata, a função retornará um valor de " 1 ", enquanto se nenhuma correspondência for encontrada, a função retornará um erro " N/A ". (ii) o resultado da função MATCH, em seguida, é entrado a função ÉERROS, ÉERROS (MATCH (A1, Experimental2_vs_Control! A:A, 0)), onde, se a entrada for " 1 " indicando uma correspondência foi encontrada, ele irá retornar " falso ", e se a entrada for " N/A " indicando uma correspondência não foi encontrada, ele irá retornar " verdade ". (iii) o " TRUE " ou " falso " resultado então é entrada para a função se, se (ISERROR (MATCH (A1, Experimental2_vs_Control! A:A, 0)), " ", " duplicar "), onde, se a entrada for " TRUE " indicando uma correspondência não foi encontrada, ele irá retornar o valor entre o primeiro conjunto de aspas (" ") que está vazio e, portanto, a célula será vazia. Se a entrada for " falso " indicando uma correspondência foi encontrada, ele irá retornar o valor entre o segundo conjunto de aspas (" duplicar "), e a célula vai dizer " duplicar ". - Imprensa " Enter " ou " voltar " para executar a equação. Selecione a célula que contém a equação e clique na caixa no canto inferior direito da célula. Manter o mouse clicado e arraste a área selecionada toda a maneira para baixo a coluna até a última ' recurso ID ', para copiar a equação para cada célula na coluna.
- Select " Custom tipo " novamente, adicionar um segundo nível de classificação clicando o " + " ícone no canto inferior esquerdo. No primeiro nível, " classificar por ", em Selecionar coluna " duplicar ", em selecione Classificar na ' valores ' e em selecionar ordem ' Z a '. No segundo nível, " por ", em Selecionar coluna ' LFC ', em selecione Classificar na ' valores ' e em selecionar ordem ' maior para o menor ' e selecione " Okey ".
Nota: Isto irá classificar a lista de genes em 4 grupos, com base na direção da mudança de expressão. É importante verificar os genes encontrados em ambas as condições experimentais para garantir que a mudança na expressão é na mesma direção em ambos os casos, ou em direções opostas. - Remover qualquer parênteses da coluna de símbolos do gene, antes de prosseguir ou os resultados não serão encontrados nos bancos de dados. Selecione a coluna inteira que contém símbolos de gene. Selecione " editar " então " substituir " no menu drop-down ' arquivo ' menu. Tipo " (*) " no " encontrar o que: " barra do substituir janela e deixar o " substituir com: " bar vazio. Selecione ' substituir todos os ' para remover todas as instâncias de parênteses.
Nota: O * representa qualquer número de caracteres, colocando este caractere entre dois parênteses, o programa é solicitado a localizar qualquer instância nas células realçadas e qualquer instância de parênteses será substituído por nada, assim, removê-los.
- Selecione a primeira célula em uma coluna vazia no 1 Experimental contra a planilha de controle para determinar diferencialmente expressos genes encontrados em duas condições experimentais. Digite a seguinte equação para a célula:
- comparando uma única condição experimental versus controle
- Determinantes enriquecido vias
- copiar os símbolos de gene do conjunto para o qual pretende determinar os caminhos enriquecidos para a área de transferência. Ir para ConsensusPathDB 12. Selecione " Gene definir análise " na barra lateral esquerda da página, seguido de " análise de sobre-representação ".
- Cole a lista de genes no " colar uma lista de identificadores de gene/proteína " caixa. Símbolo do gene selecione a " tipo de identificador do Gene/proteína " caixa e clique em " continuar ". Marque a caixa ao lado de " caminhos definidos pelos bancos de dados via " sob a base de caminho define seção.
Nota: Um número de opções para a análise aparecerá incluindo a lista de bancos de dados disponíveis para pesquisar. Recomenda-se de selecionar todos os bancos de dados, exceto os bancos de dados Kegg e Reactome, como eles são os mais estabelecida e abrangente. A sobreposição mínima com entrada configurações lista e p-valor de corte também pode ser ajustada com base nas necessidades. Recomendamos deixar essas configurações na sobreposição mínima de 2 gene padrão e um limite de valor 0,01 p. - Select " encontrar enriquecido de moda " para obter a lista de caminhos que contêm genes na lista de entrada.
Nota: A saída será em formato de tabela, incluindo o nome de cada percurso seguido por " definir tamanho " (indicando o número de genes totais na via), " candidatos contidos " (indicando o número de genes na lista de entrada que estão no caminho que ), bem como o valor-p e q-valor (FDR) e o banco de dados do qual foi identificado o pathway.
- Geração de redes via
- determinar caminhos enriquecidos, como descrito acima.
- Todos os caminhos enriquecidos de Visualizar em uma rede de caminho selecionando cada caixa ao lado dos nomes de caminho para ser visualizado ou clicando em selecionar " todos os " sob " selecione " no cabeçalho da coluna acima as caixas de seleção, selecione " Visualizar conjuntos selecionados ".
Nota: Recomendamos a visualização de todos os percursos se houver menos de 30; Se houver maior que 30 vias recomendamos selecionar as top 30 vias mais enriquecidas (aqueles que contêm o maior número de genes da lista de entrada). - Ajustar o " sobreposição relativa " e " compartilhado candidatos " filtros, selecionando ou caixa no centro superior da página e introduzir desirpor cento de Ed relativo se sobrepõem ou número de candidatos compartilhados, para ser mais rigorosas a fim de tornar o mais pertinente sobrepõe dentro das redes de caminho mais claras e selecionadas " aplicar ".
Nota: Recomendamos uma sobreposição mínima relativa de 0,2, indicando uma sobreposição de gene de 20% entre 2 caminhos para conectá-los e um mínimo de 2 candidatos compartilhados. A legenda do gráfico pode ser vista clicando-se na lenda de gráfico no canto superior esquerdo da página.
- Determinação dos termos GO enriquecidos
- copiar os símbolos do gene do grupo para o qual deseja determinar as ontologias gene enriquecido para a área de transferência. Vá para o ' ferramenta de análise de enriquecimento GO ' no Gene Ontology consórcio 13. Cole a lista de símbolos de gene na caixa do lado esquerdo da página sob " seu gene IDs aqui … "
- selecionar qual conjunto de termos de ir usar, listados por baixo da caixa de IDs de gene: processo biológico, função molecular ou componente celular. Escolha (recomendado) ' processo biológico '. Selecione ' Danio rerio ' debaixo do GO termos caixa e clique em " enviar ".
Nota: Recomendamos a utilização do corte de p-valor padrão de 0,05.
5. Verificação por qRT-PCR
Nota: genes individuais identificados com as mudanças de expressão de gene significativo no RNASeq devem ser verificados por qRT-PCR alvo em replicar experiências.
- síntese do cDNA
- extrair o RNA de embriões utilizando o método descrito na secção 3.1. Extração do RNA.
- Converter 1 µ g de RNA de cDNA usando cDNA conversão kit (veja a Tabela de materiais). Combine o RNA, dNTPs e enzima transcriptase reversa. Realizar a reação de thermocycler de acordo com o fabricante ' especificações do s.
- Diluir cDNA 1:3 em água tratada DEPC. Loja a 4 ° C por até 1-2 meses.
- verificação de qRT-PCR
- selecionar genes para verificar por qRT-PCR de resultados do sequenciamento de RNA. Identifica genes com alta prega mudanças na expressão. Determinar qual destes genes também contêm altas contagens de leitura, já que indica expressão abundante.
- Selecionar 10-12 alvos da mudança alta dobra, lista de alta contagem de leitura de genes. Desenho de primers para amplificar o gene-alvo que se estendem pelo menos 1 limite de intron-exon.
- Entra o gene ou região de destino do gene em qPCR cartilha projeto local 14. Selecione o " 2 primeiras demão qPCR de design " e solicitar o site para criar cartilha conjunto.
Nota: Certifique-se de incluir iniciadores de controle interno, tais como β-actina, para normalizar as comparações entre as amostras. Os primers de β-actina são 5 f: ' - TCGAGCTGTCTTCCCATCCA - 3 ' e 5 r: ' - TCACCAACGTAGCTGTCTTTCTG - 3 '. - Combinar o cDNA, encaminhar cartilha, cartilha reversa e polimerase. Executar a amplificação de qRT-PCR para determinar a expressão relativa dos genes 15.
- Analisar a expressão de mRNA relativo dos genes de interesse pela quantificação relativa determinação 15.
- Comparar o qRT-PCR para RNASeq resultados para garantir que a direcionalidade de expressão diferencial é consistente.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Classificação de diferencialmente expressos Genes:
Para identificar genes diferencialmente expressos na fase larval de zebrafish modelos de síndrome de Alström e síndrome de Bardet-Biedl (BBS), escolhemos a qualquer alms1 ou bbs1 transcrições injetando validados anteriormente da tala-MOs em bloqueio zebrafish do selvagem-tipo embriões16,17. Em 5 dias pós fertilização (dpf), duas repetições de RNA foram extraídas de cada condição, bem como os embriões injetados com controle MO, conforme descrito na seção 3 acima. RNA de cada amostra foi sequenciado a uma profundidade de ~ 120 milhões lê com ~ 107 milhões lê alinhado com o genoma do zebrafish. Entre 85-90% das leituras alinhadas mapeado para exônicos regiões do genoma.
1.348 genes totais foram significativamente alterados no modelo de Alström e 471 totais genes foram alterados significativamente no modelo BBS. Compartilhada alterações na expressão gênica entre os modelos ou as alterações exclusivas para um dos modelos foram identificadas conforme descrito na seção 4.2. 1.084 totais genes foram alterados exclusivamente no modelo de Alström, 612 acima-está regulada e 472 para baixo-regulado e 207 genes foram alterados exclusivamente no modelo BBS, 176 acima-está regulada e 31 para baixo-regulado (Figura 2, Tabela S1e S2 de tabela). 264 genes foram encontrados para ser significativamente alterada em ambos os modelos, 73 foram acima-está regulada e 182 foram para baixo-regulado e 9 mostrou alterações opostas na expressão entre os dois modelos (Figura 2, Tabela S1e S2 de tabela (ver Tables.xlsx suplementar)). Os números discrepantes de genes diferencialmente expressos entre os dois modelos sugerem que bbs1 e alms1 podem impactar diferentes estágios de desenvolvimento.
Curiosamente, o grande número de genes diferencialmente expressos no modelo de Alström sugere que alms1 desempenha um papel importante no desenvolvimento na fase 5 dpf, enquanto o menor número de alterações do gene no modelo BBS sugere que o papel do bbs1 pode não ser tão proeminente neste ponto do tempo. Em contraste, análises de transcriptomic anteriores no dpf 2 sugeriram o reverso18.
Determinação das vias enriquecidas e Gene ontologias no Zebrafish modelo de síndrome de Alström:
Para elucidar mais claramente o perfil molecular do modelo Alström, foram identificadas as vias e ontologias gene enriquecidas nos genes diferencialmente expressos. Caminhos enriquecidos foram determinados consultando o ConsensusPathDB e enriquecido de Gene de ontologias foram determinadas consultando o Gene Ontology consórcio conforme descrito nas seções 4.3-4.5. O mais altamente enriquecido entre os genes acima-está regulada na Alström modelo, pelo número de genes ou dobre o enriquecimento, foram analisado. 31 vias totais foram acima-está regulada no modelo de Alström. Além do enorme agrupamento de "metabolismo", os caminhos mais altamente afetados foram a imunidade inata e adaptativa com genes de 32 e 20, respectivamente (Figura 3A). Receptor de células β a jusante, sinalização de eventos também foram enriquecidos sugerindo regulação sistema imune neste modelo. Diversas vias de sinalização também foram enriquecidas entre os genes acima-está regulada no modelo de Alström, consistente com a associação de síndrome de Alström com disfunção cílio primário, um grande centro de sinalização da célula (Figura 3A). Além disso, três vias associadas com a secreção de insulina foram acima-regulada: ácidos graxos ligados a GPR40, ácidos graxos livres e acetilcolina (Figura 3A). Isto é consistente com os fenótipos altamente penetrante insulina resistência e tipo 2 diabetes em pacientes de Alström. Termos de ir seis foram enriquecidos entre os genes acima-está regulada no modelo de Alström, incluindo diferenciação dos eritrócitos, homeostase de eritrócitos, homeostase de células mieloides e processos homeostáticos (Figura 3B). Para avaliar a interligação das vias acima-regulada, uma rede de caminho da Alström caminhos acima-regulada do modelo foi gerado (Figura 3). O nó principal das vias interconectadas revelou um alto grau de conectividade entre os caminhos associados com o sistema imunológico e sinalização, enquanto um dos menores nós revelou a conectividade entre as vias regulamentares três insulina. Finalmente, verificamos que as mudanças de expressão de gene identificadas por RNASeq pela avaliação de 5 alvos de gene, que eram ambos acima - ou para baixo-regulado no modelo de Alström. A direção das mudanças de expressão do gene por qRT-PCR em aste gck, bmb, btr26 e ifi35, em relação ao controle, instaurada que observado por RNASeq (Figura 4A–B).
Figura 1. Saída representativa da análise de expressão de gene após RNASeq fornecido pelo fornecedor ou núcleo. ID de recurso indica o número de identificação do gene ENSEMBL. Contagens de leitura indica o número de leituras no controle ou amostras experimentais que alinhados com esse gene no genoma. Mudança de dobra e o log da prega mudança indicam o grau de mudança na expressão do gene entre o experimental e controlam amostra em ambos o positivo (aumento) em expressão na direção da amostra experimental ou negativo (diminuição) na expressão na direção da amostra experimental. O p-valor e FDR são testes estatísticos para determinar o significado dos resultados; para experiências de RNASeq, um valor FDR mais rigoroso de 0,05 é usado para determinar o significado. Gene_symbol indica a identificação do gene NCBI, e gene_name lista o nome completo do gene. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Diferencialmente expressos genes nos modelos de BBS e Alström. Número de genes regulados por cima (vermelho) ou para baixo-regulado (amarelo) em alms1 MO (verde) injetado embriões, embriões de MO (laranja) injetado bbs1 ou ambos em comparação com embriões de MO injetado de controle padrão. * Denota o número de genes alterados em ambos, mas tendo em frente a mudanças na expressão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
FIkuren 3. Upregulated caminhos e enriquecidos termos GO no modelo de Alström. (A) Upregulated caminhos pelo número de genes. (B) Upregulated ir termos pelo enriquecimento de dobra. (C) conectividade via upregulated vias no modelo de Alström. Conexões via determinadas por um mínimo de 20% compartilhada genes entre vias e pelo menos 2 genes se sobrepõem. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. validação de qRT-PCR de mudanças de expressão de gene. Alterações na expressão gênica, identificado por RNASeq, foram confirmadas na idade - e tratamento-combinada dpf 5 embriões, injetados com controle, alms1 ou bbs1 MO. (A) subconjunto dos genes mostrando a expressão do mRNA de genes usando qRT-PCR. (B) dados equivalentes mostrando leitura conta do conjunto de dados RNASeq. Todos os dados são relativos a controle e qRT-PCR foram normalizados de actina. Aste, asteroide homólogo 1; GCK, glucoquinase; BMB, brambleberry; btr26, família de genes relacionados ao sanguinário, membro 26; ifi35, proteína induzida por interferon 35. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
A abordagem descrita no presente protocolo oferece uma estratégia relativamente rápida e econômica para a análise do transcriptoma-nível de animais inteiros ou populações de célula específica classificada. O peixe-zebra fornece um modelo de vantajoso para este tipo de estudo devido a facilidade e a rapidez na geração de grandes quantidades de começar o material, a facilidade de aplicação genética ou ambientais condições experimentais e a disponibilidade de um grande espectro de linhas transgénicas repórter permitindo isolamento de populações específicas e tecido-específica de tipo de célula.
Embora não detalhadas aqui, esse método poderia acomodar facilmente coletados de peixes juvenis ou adultos como uma alternativa ao FACs e coleção de cortes de tecido. Também desenvolvemos uma estratégia de acompanhamento de análise básica que só se baseia na utilização de comandos básicos de planilha e caminho pré-existentes e GO bancos de dados. A principal vantagem desta abordagem é a facilidade de acessibilidade, sem a necessidade de conhecimentos de alto nível em gestão de banco de dados ou programação de computadores. Como tal, esta estratégia é aplicável para os investigadores de todas as origens para informativo análise do gene de grandes conjuntos de dados de expressão.
Nossa abordagem combina embrião zebrafish básica e cultura larval com técnicas de extração de RNA padrão seguidas por RNASeq. RNASeq requer uma grande quantidade de material de partida de alta qualidade; alguns vendedores necessitam de 2 µ g de RNA total. Como resultado, tipos de células raras/infrequente ou análise individual do embrião está fora do alcance. No entanto, nos últimos cinco anos têm demonstrado melhorias dramáticas nas análises de baixo rendimento, conjuntos de dados gerados a partir de amostras menores e menores quantidades de RNA, e esperamos que esses aplicativos será possíveis no futuro próximo. Para garantir resultados precisos, a adição de ambas as réplicas técnicas, ou seja, gerando duas bibliotecas de RNA a partir de uma única amostra e repetições biológicas, ou seja, coleta de embriões de vários acasalamentos, é ideal. Estas etapas permitem aos pesquisadores controle variação nas amostras, e sequências identificadas em todas as amostras são mais propensos a ser verdadeiros resultados, com a reduzida probabilidade de falta um resultado de leitura-contagem inferior.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pelo R01DK102001 (N.A.Z.), P30DK072488 (N.A.Z.) e T32DK098107 (T.L.H. e J.E.N.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Commercial Reagents | |||
| TriZol | Thermo Scientific | 15596026 | lysis reagent |
| TrypLE | Gibco | 12604013 | dissociation buffer 1 |
| FACSMax | Genlantis | T200100 | dissociation buffer 2 |
| DEPC-treated water | Sigma | 95284 | |
| FirstStrand cDNA conversion | Thermo Scientific | K1621 | cDNA conversion kit |
| 2X SYBR Green Master Mix | Roche | 4707516001 | qRT-PCR Master Mix |
| FACS buffer | Fisher Scientific | 50-105-9042 | |
| chloroform | Sigma Aldrich | 288306 | |
| sodium acetate | Sigma Aldrich | S2889 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Zebrafish Strains | |||
| Tuebingen | ZIRC | ZL57 | |
| ins2a:mCherry | ZIRC | ZL1483 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| 40 micron cell strainer | Sigma | CLS431750 | |
| FACS tube | BD Falcon | 352063 | |
| hemocytometer | Sigma | Z359629 | |
| Dissecting Microscope | Zeiss | ||
| Inverted Microscope | Zeiss | ||
| Nanodrop | Thermo Scientific | ||
| Illumina HiSeq | Illumina | ||
| LightCycler 480 | Roche | ||
| Mating tanks 1.0L Crossing Tank Set | Aquaneering | ZHCT100 | |
| FACS tube 5 mL polypropylene tube | BD Falcon | 352063 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Excel | Microsoft | ||
| Consensus Path DB | http://cpdb.molgen.mpg.de/ | ||
| GO Enrichment Analysis | http://geneontology.org/page/go-enrichment-analysis |
References
- Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. Zebrafish. , Oxford University Press. (2002).
- Detrich, H. W., Zon, L., Westerfield, M. The Zebrafish: Disease Models and Chemical Screens. , 4th ed, Academic Press. (2017).
- Detrich, H. W., Zon, L. I., Westerfield, M. The Zebrafish: Genetics, Genomics, and Transcriptomics. , 4th ed, Academic Press. (2016).
- Detrich, H. W. The Zebrafish: Genetics, Genomics and Informatics. , 3rd ed, Academic Press. (2011).
- Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction. J Vis Exp. (69), e4196 (2012).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J Vis Exp. (25), (2009).
- Hwang, W. Y., et al. Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system. Nat Biotechnol. 31 (3), 227-229 (2013).
- Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , 4th ed, Univ. of Oregon Press. Eugene. (2000).
- Rossi, A., et al. Genetic compensation induced by deleterious mutations but not gene knockdowns. Nature. 524 (7564), 230-233 (2015).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F.
- Samsa, L. A., Fleming, N., Magness, S., Qian, L., Liu, J. Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos. J Vis Exp. (109), (2016).
- MPIMG. ConsenusPathDB. , Available from: http://cpdb.molgen.mpg.de/ (2017).
- Consortium, G. O. Enrichment analysis Tool. , Available from: http://www.geneontology.org/ (2017).
- IDT. IDT Primerquest Tool. , Available from: https://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index (2017).
- Heid, C. A., Stevens, J., Livak, K. J., Williams, P. M.
- Leitch, C. C., Lodh, S., Prieto-Echague, V., Badano, J. L., Zaghloul, N. A. Basal body proteins regulate Notch signaling through endosomal trafficking. J Cell Sci. 127 (Pt 11), 2407-2419 (2014).
- Lodh, S., Hostelley, T. L., Leitch, C. C., O'Hare, E. A., Zaghloul, N. A. Differential effects on beta-cell mass by disruption of Bardet-Biedl syndrome or Alstrom syndrome genes. Hum Mol Genet. 25 (1), 57-68 (2016).
- Hostelley, T. L., Lodh, S., Zaghloul, N. A. Whole organism transcriptome analysis of zebrafish models of Bardet-Biedl Syndrome and Alstrom Syndrome provides mechanistic insight into shared and divergent phenotypes. BMC Genomics. 17, 318 (2016).
