Количественная оценка человека Моноцит хемотаксис в пробирке и мышиных лимфоцитов, торговля в естественных условиях
Summary
Протоколы для количественной оценки лимфоцитов хемотаксис и миграции являются важными инструментами для исследования иммунологии. Здесь в пробирке Протокол описан, позволяет в реальном времени, мультиплексируются оценки миграции клеток, а также дополнительных в vivo техника благоприятных отслеживания собственных клеток селезенки.
Abstract
Хемотаксис — миграции вдоль определенных химических градиента1. Chemokines — эозинофилов цитокины, которые способствуют сотовой оборота с анатомическими и временных специфика2. Хемотаксис является критической функции лимфоцитов и другие иммунные клетки, которые могут быть количественно оценены в пробирке. Эта рукопись описывает методы, которые позволяют оценки хемотаксис, как in vitro , так и в естественных условиях, для типов различных клеток, включая клеточные линии и родной клетки. В пробирке, плита-формат допускает сравнение нескольких условий одновременно в режиме реального времени и может быть завершена в течение 1-4 ч. В vitro пробирного условий можно манипулировать, чтобы ввести агонистов и антагонистов, как хорошо, как дифференцировать хемотаксис от chemokinesis, который является случайное движение. В естественных условиях торговли людьми оценок иммунные клетки может помечены с несколькими флуоресцентными красителями и используется для передачи в приемную. Дифференциальный маркировки клеток позволяет смешанных клеточных популяций в то же самое животное, тем самым снижения дисперсии и сократить количество животных, необходимых для эксперимента надлежащим питанием. Миграция в лимфоидной ткани происходит всего за 1 h, и можно отведать несколько отсеков ткани. Проточной цитометрии после урожая тканей позволяет для быстрого и количественный анализ миграционных моделей из нескольких типов клеток.
Introduction
Надежный иммунитет требует сложных временных и пространственных координации множества типов клеток для того чтобы надлежащим образом реагировать на травмы, инфекции и генерировать self-tolerance. Было обнаружено несколько десятков хемокиновых рецепторов и их соответствующие лигандов и характеризуется предоставление молекулярных механизмов, какие конкретные ячейки могут быть направлены в конкретной ткани в определенное время. Таким образом изучая хемотаксис и миграции является неотъемлемым компонентом исследования иммунологии. Действительно описанных в vitro assay недавно использовался как инструмент скрининга для выявления эозинофилов кофакторы, что ускоряет хемотаксис Т-клеток к chemokines 19 и 21 C-C3. Методы, описанные здесь, разрешить количественные оценки иммунных клеток хемотаксис в пробирке и в естественных условиях.
Пробирная палата Бойден (миграции клеток и вторжения) это недорогой, воспроизводимые и быстрый метод для оценки миграции клеток4,5. В стандартной assay верхняя палата заполняется с клетками и отделяется пористые вставки из нижней палаты, в которой клетки мигрируют. В нужное время клетки, которые мигрировали на нижней пластины можно фиксированной и запятнана световой микроскопии для quantitation. Однако такие измерения ограничить сбор данных для одной конечной точки, которая исключает возможность сбора динамических данных и может требовать обширные оптимизации для определения оптимального времени точки для анализа. Здесь описаны несколько приспособлений, которые позволяют в реальном времени, количественные и мультиплексных измерения хемотаксис в пробирке.
В vivo исследований, используется функциональный конечной точки, а именно конкретные накопления клеток в отсеке данной ткани. Предварительно обозначенных донором клетки вводятся в получателей животных через приемные передачи. Впоследствии эти клетки донора может быть идентифицирован проточной цитометрии, после сбора урожая получателей ткани. Также представлен совместной маркировки стратегия, которая позволяет для определения торговли людьми из различных типов клеток в пределах одного получателя животных. Этот метод устраняет между животных отклонения от инъекции клеток и приходится физиологического между животных изменчивости.
Protocol
Representative Results
Discussion
Количественная оценка миграции иммунных клеток может быть достигнуто с помощью простой и быстрый assays в пробирке и в естественных условиях. Мы демонстрируем хемотаксис в vitro человека моноцитов в ответ на МКП-1 градиента и увеличение в сыворотке крови. В естественных усл?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана программа Шварц Бернард л для врача ученые Университета Рокфеллера, Робертсон терапевтического фонда развития в университете Рокфеллера и Саклера центр биомедицины и питания исследований Рокфеллеровский университет.
Materials
| RPMI-1640 | Thermo Fisher Scientific | 11875-093 | |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific | 15630-080 | |
| Fetal Bovine Serum | ATCC | 30-2020 | |
| Cell culture flask | Corning | 353136 | |
| Calcein AM | Thermo Fisher Scientific | C1430 | Excitation: 485nm, Emission: 520nm |
| Cell culture dish | Corning | 1007 | |
| 24 well plate | Corning | 353504 | |
| Fluoroblok Fibronectin Insert | Corning | CB354597 | |
| 15 mL conical tube | Corning | 352097 | |
| Bovine Serum Albumin | Cell Signaling Technology | 9998S | |
| Human Recombinant MCP-1 | Peprotech | 300-04 | |
| Adult bovine Serum | Sigma | B9433 | |
| HBSS with calcium and magnesium; no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 14025-092 | |
| SpectraMax M2e plate reader | Molecular Devices | ||
| Olympus IX71 inverted fluorescence microscope | Olympus | ||
| Isothesia | Henry Schein animal health | 11695-6776-2 | Isofluorane anesthesia |
| Cell strainer 40um nylon | Falcon Corning | 352340 | |
| ACK lysing buffer | Quality Biological | 118-156-101 | |
| CellTracker Orange CMTMR Dye | Thermo Fisher Scientific | C2927 | Excitation: 541nm, Emission: 565nm |
| CellTracker Green CMFDA Dye | Thermo Fisher Scientific | C2925 | Excitation: 485nm, Emission: 520nm |
| 5ml syringe | BD Syringe | 309646 | |
| 1ml TB syringe | BD Syringe | 309625 | |
| THP-1 cell line | ATCC | TIB-202 | |
| Brilliant Violet 421 anti-mouse CD3 Antibody | Biolegend | 100228 | Excitation: 405nm, Emission: 421nm |
| Brilliant Violet 605 anti-mouse CD19 Antibody | Biolegend | 115540 | Excitation: 405nm, Emission: 603nm |
| 96-well round bottom plate | Corning | 353077 | |
| LSRII | BD Biosciences | Flow cytometer |
References
- Griffith, J. W., Sokol, C. L., Luster, A. D. Chemokines and chemokine receptors: positioning cells for host defense and immunity. Annu Rev Immunol. 32, 659-702 (2014).
- Springer, T. A. Traffic signals for lymphocyte recirculation and leukocyte emigration: the multistep paradigm. Cell. 76 (2), 301-314 (1994).
- Ponda, M. P., Breslow, J. L. Serum stimulation of CCR7 chemotaxis due to coagulation factor XIIa-dependent production of high-molecular-weight kininogen domain 5. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (45), E7059-E7068 (2016).
- Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. J Exp Med. 115, 453-466 (1962).
- Chen, H. C. Boyden chamber assay. Methods Mol Biol. 294, 15-22 (2005).
- Tsuchiya, S., Yamabe, M., Yamaguchi, Y., Kobayashi, Y., Konno, T., Tada, K. Establishment and characterization of a human acute monocytic leukemia cell line (THP-1). Int J Cancer. 26 (2), 171-176 (1980).
- Leonard, E. J., Yoshimura, T. Human monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1). Immunol Today. 11 (3), 97-101 (1990).
- Crouch, M. F. An automated fluorescence based assay of neurite formation. J Neurosci Methods. 104 (1), 87-91 (2000).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Poot, M., Kavanagh, T. J., Kang, H. C., Haugland, R. P., Rabinovitch, P. S. Flow cytometric analysis of cell cycle-dependent changes in cell thiol level by combining a new laser dye with Hoechst 33342. Cytometry. 12 (2), 184-187 (1991).
- West, C. A., He, C., Su, M., Swanson, S. J., Mentzer, S. J. Aldehyde fixation of thiol-reactive fluorescent cytoplasmic probes for tracking cell migration. J Histochem Cytochem. 49 (4), 511-518 (2001).
- Kim, C. H. The greater chemotactic network for lymphocyte trafficking: chemokines and beyond. Curr Opin Hematol. 12 (4), 298-304 (2005).
