人单核细胞趋化体外和小鼠淋巴细胞贩运体内
Summary
淋巴细胞趋化和迁移定量评估的协议是免疫学研究的重要工具。在这里, 一个体外协议的描述, 允许 real-time, 多路复用的细胞迁移评估, 以及一个互补的体内技术, 使本机细胞跟踪脾脏。
Abstract
趋化是沿着特定的化学渐变1进行迁移。趋化因子是趋细胞素, 促进细胞贩运的解剖和时间特异性2。趋化性是淋巴细胞和其他免疫细胞的重要功能, 可以定量评估体外。这份手稿描述的方法, 允许评价的趋化性, 无论是体外和在体内, 不同的细胞类型, 包括细胞株和本机细胞。体外, plate – based 格式允许在 real – time 中同时进行多个条件的比较 , 并且可以在 1 – 4 小时内完成 .体外化验条件可以纵引入激动剂和拮抗药 , 以及区分趋化与 chemokinesis, 这是随机运动。对于体内的贩运评估, 免疫细胞可以用多种荧光染料标记, 并用于过继转移。细胞的差别标记允许混合细胞的人口被引入到相同的动物, 从而减少方差和减少动物的数量, 需要一个充分的动力实验。迁移到淋巴组织发生在1小时, 和多个组织隔间可以取样。组织收获后的流式细胞术可以快速定量分析多种细胞类型的迁移模式。
Introduction
强健的免疫力需要复杂的时间和空间协调的各种细胞类型, 以适当的反应, 以伤害, 感染和产生发生。发现了几十种趋化因子受体及其相应的配体, 并提供了分子机制, 使特定的细胞能够在特定的时间内被定向到特定的组织中。因此, 研究趋化和迁移是免疫学研究的一个不可缺少的组成部分。事实上, 所描述的体外检测方法最近被用作筛选工具, 用于识别趋因子, 加速 T 细胞向 c-c 趋化因子19和 213的趋性。这里描述的方法的目的是允许定量评估免疫细胞趋化性在体外和在体内。
博伊登 (细胞迁移和侵入) 室检测是一种廉价, 可重现, 快速评估细胞迁移的方法4,5。在标准的化验中, 上部的腔室与细胞一起播种, 并由较低腔内的多孔插入物隔开, 细胞迁移到其中。在所需时间, 迁移到插入的底部的细胞可以固定和染色的光显微镜定量。但是, 此类测量将数据收集限制在单个端点, 这就排除了动态数据收集, 并且需要进行广泛的优化以确定最佳的分析时间点。在这里, 一些适应的描述, 允许 real-time, 定量和多路测量的趋化性在体外。
对于在体内的研究, 使用一个功能终点, 即特定组织室中细胞的具体积累。预标记的供体细胞通过过继转移引入受体动物。这些供体细胞随后可以通过流式细胞术在受体组织收获后进行识别。还提出了一个 co-labeling 的战略, 允许确定在单一受体动物的不同细胞类型的贩运。这种方法消除了细胞注射的 inter-animal 变异, 并解释了生理 inter-animal 变异性。
Protocol
Representative Results
Discussion
免疫细胞迁移的定量化可以通过简单和快速的检测来实现, 这两种方法都是体外和体内。我们证明了体外对人单核细胞的趋化反应的 MCP-1 梯度和增强血清。在体内, 供体小鼠脾有差异标记和继过继转移后, 从接受动物中回收。
使用平板阅读器的优点是采样几个时间点 (像每年三十年代一样频繁) 和自动化迁移细胞的定量。这省却需要选择一个单一的时…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了伯纳德. 施瓦茨计划的支持, 洛克菲勒大学的医生科学家, 洛克菲勒大学的罗伯逊治疗发展基金, 和克生物医学和营养学研究中心在洛克菲勒大学
Materials
| RPMI-1640 | Thermo Fisher Scientific | 11875-093 | |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific | 15630-080 | |
| Fetal Bovine Serum | ATCC | 30-2020 | |
| Cell culture flask | Corning | 353136 | |
| Calcein AM | Thermo Fisher Scientific | C1430 | Excitation: 485nm, Emission: 520nm |
| Cell culture dish | Corning | 1007 | |
| 24 well plate | Corning | 353504 | |
| Fluoroblok Fibronectin Insert | Corning | CB354597 | |
| 15 mL conical tube | Corning | 352097 | |
| Bovine Serum Albumin | Cell Signaling Technology | 9998S | |
| Human Recombinant MCP-1 | Peprotech | 300-04 | |
| Adult bovine Serum | Sigma | B9433 | |
| HBSS with calcium and magnesium; no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 14025-092 | |
| SpectraMax M2e plate reader | Molecular Devices | ||
| Olympus IX71 inverted fluorescence microscope | Olympus | ||
| Isothesia | Henry Schein animal health | 11695-6776-2 | Isofluorane anesthesia |
| Cell strainer 40um nylon | Falcon Corning | 352340 | |
| ACK lysing buffer | Quality Biological | 118-156-101 | |
| CellTracker Orange CMTMR Dye | Thermo Fisher Scientific | C2927 | Excitation: 541nm, Emission: 565nm |
| CellTracker Green CMFDA Dye | Thermo Fisher Scientific | C2925 | Excitation: 485nm, Emission: 520nm |
| 5ml syringe | BD Syringe | 309646 | |
| 1ml TB syringe | BD Syringe | 309625 | |
| THP-1 cell line | ATCC | TIB-202 | |
| Brilliant Violet 421 anti-mouse CD3 Antibody | Biolegend | 100228 | Excitation: 405nm, Emission: 421nm |
| Brilliant Violet 605 anti-mouse CD19 Antibody | Biolegend | 115540 | Excitation: 405nm, Emission: 603nm |
| 96-well round bottom plate | Corning | 353077 | |
| LSRII | BD Biosciences | Flow cytometer |
References
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