Quantificar o humano Monocyte Chemotaxis In Vitro e linfócitos murino tráfico Vivo
Summary
Protocolos para avaliação quantitativa da quimiotaxia de linfócitos e migração são ferramentas importantes para pesquisa de Imunologia. Aqui, um protocolo em vitro é descrito que permite em tempo real, multiplexados avaliação da migração celular, bem como um complementares na vivo técnica permitindo rastreamento de células nativas para o baço.
Abstract
Quimiotaxia é a migração ao longo de um gradiente químico específico1. Quimiocinas são Quimiotáticos citocinas que promovem o tráfico celular com especificidade anatómica e temporal2. Quimiotaxia é uma função crítica de linfócitos e outras células do sistema imunológico que podem ser quantitativamente avaliada em vitro. Este manuscrito descreve métodos que permitem a avaliação da quimiotaxia, tanto in vitro e em vivo, para tipos de diversas células incluindo linhas celulares e células nativas. O em vitro, formato baseado na placa permite a comparação das várias condições simultaneamente em tempo real e pode ser concluída dentro de 1-4 h. em vitro ensaio condições podem ser manipuladas para introduzir-se como agonistas e antagonistas, bem como diferencia quimiotaxia de chemokinesis, que é o movimento aleatório. Na vivo avaliação do tráfico, de células do sistema imunológico podem ser rotuladas com vários corantes fluorescentes e usadas para transferência adotiva. A rotulagem diferencial de células permite a populações de células mistas a ser introduzido o mesmo animal, assim, diminuindo a variância e reduzindo o número de animais necessários para uma experiência adequadamente alimentada. Migração no tecido linfoide ocorre em menos de 1h, e vários compartimentos de tecido podem ser saboreados. Citometria de fluxo após a colheita de tecidos permite uma análise rápida e quantitativa dos padrões migratórios de vários tipos de células.
Introduction
Imunidade robusta requer a coordenação temporal e espacial complexa de uma miríade de tipos de células, a fim de responder adequadamente a uma lesão, infecção e gerar auto-tolerância. Várias dezenas de receptors do chemokine e seus ligantes correspondentes foram descobertos e caracterizados fornecendo mecanismos moleculares pelos quais células específicas podem ser direcionados em um tecido específico em um tempo específico. Assim, estudar a quimiotaxia e a migração é um componente indispensável de pesquisa de Imunologia. Com efeito, o ensaio descrito em vitro recentemente foi usado como uma ferramenta de triagem para identificar um cofactor quimiotático que acelera a quimiotaxia de células T em direção de quimiocinas, 19 e 21 C C3. A finalidade dos métodos descritos aqui são para permitir avaliações quantitativas de célula imune quimiotaxia em vitro e in vivo.
O ensaio de câmara Boyden (migração celular e invasão) é um método barato, reprodutível e rápido para avaliar a migração de células4,5. No ensaio de padrão, a câmara superior é semeada com células e é separada por uma inserção porosa de uma câmara inferior, na qual as células migram. No momento desejado, células que migraram para a parte inferior da inserção podem ser fixo e manchadas para quantificação por microscopia de luz. No entanto, tais medições restringem a coleta de dados para um único ponto de extremidade, o que impede a coleta de dados dinâmico e podem exigir a otimização extensiva para determinar o ponto ideal de tempo para análise. Aqui, várias adaptações são descritas que permite medições em tempo real, quantitativas e multiplexadas de quimiotaxia em vitro.
Estudos em vivo , é usado um ponto de extremidade funcional, ou seja, o acúmulo específico de células em um compartimento de determinado tecido. Células de doador previamente rotulado são introduzidas animais destinatários através de transferência adotiva. Estas células de doador posteriormente podem ser identificadas por citometria de fluxo após a colheita de tecidos destinatário. Também apresentado é uma estratégia co rotulagem que permite a determinação do tráfico de diferentes tipos de células dentro de um único animal de destinatário. Esse método elimina a variação entre animais da injeção de célula, contas e variabilidade fisiológica de animal para animal.
Protocol
Representative Results
Discussion
Quantificação da migração celular imune pode ser realizada usando simples e rápida os ensaios in vitro e em vivo. Demonstramos a em vitro quimiotaxia de monócitos humanos em resposta a um gradiente de MCP-1 e aumento pelo soro. In vivo, doador murino splenocytes diferencialmente foram rotulados e após transferência adotiva, foram recuperados do destinatários animais.
Usando um leitor de placa tem a vantagem de vários pontos de tempo de amostragem (…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado pelo programa Bernard L. Schwartz para cientistas de médico na Universidade Rockefeller, fundo de desenvolvimento terapêutico de Robertson da Universidade Rockefeller, e o centro de Sackler de Biomedicina e nutrição pesquisa na Universidade de Rockefeller.
Materials
| RPMI-1640 | Thermo Fisher Scientific | 11875-093 | |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific | 15630-080 | |
| Fetal Bovine Serum | ATCC | 30-2020 | |
| Cell culture flask | Corning | 353136 | |
| Calcein AM | Thermo Fisher Scientific | C1430 | Excitation: 485nm, Emission: 520nm |
| Cell culture dish | Corning | 1007 | |
| 24 well plate | Corning | 353504 | |
| Fluoroblok Fibronectin Insert | Corning | CB354597 | |
| 15 mL conical tube | Corning | 352097 | |
| Bovine Serum Albumin | Cell Signaling Technology | 9998S | |
| Human Recombinant MCP-1 | Peprotech | 300-04 | |
| Adult bovine Serum | Sigma | B9433 | |
| HBSS with calcium and magnesium; no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 14025-092 | |
| SpectraMax M2e plate reader | Molecular Devices | ||
| Olympus IX71 inverted fluorescence microscope | Olympus | ||
| Isothesia | Henry Schein animal health | 11695-6776-2 | Isofluorane anesthesia |
| Cell strainer 40um nylon | Falcon Corning | 352340 | |
| ACK lysing buffer | Quality Biological | 118-156-101 | |
| CellTracker Orange CMTMR Dye | Thermo Fisher Scientific | C2927 | Excitation: 541nm, Emission: 565nm |
| CellTracker Green CMFDA Dye | Thermo Fisher Scientific | C2925 | Excitation: 485nm, Emission: 520nm |
| 5ml syringe | BD Syringe | 309646 | |
| 1ml TB syringe | BD Syringe | 309625 | |
| THP-1 cell line | ATCC | TIB-202 | |
| Brilliant Violet 421 anti-mouse CD3 Antibody | Biolegend | 100228 | Excitation: 405nm, Emission: 421nm |
| Brilliant Violet 605 anti-mouse CD19 Antibody | Biolegend | 115540 | Excitation: 405nm, Emission: 603nm |
| 96-well round bottom plate | Corning | 353077 | |
| LSRII | BD Biosciences | Flow cytometer |
References
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