Effektiv Generation og redigering af Feeder-gratis IPSCs fra pancreas celler ved hjælp af CRISPR-Cas9 System
Summary
Denne protokol beskriver i detaljer generation af fodaftryk-fri induceret pluripotente stamceller (iPSCs) fra pancreas menneskeceller i feeder-fri betingelser, efterfulgt af redigering bruger CRISPR/Cas9 ribonucleoproteins og karakterisering af den modificerede encellede kloner.
Abstract
Embryonale og inducerede pluripotente stamceller kan selv forny og differentiere sig til flere celletyper i kroppen. Pluripotente celler er således eftertragtede for forskning i regenerativ medicin og er i øjeblikket i kliniske forsøg for øjensygdomme, sukkersyge, hjertesygdomme og andre sygdomme. Potentiale til at differentiere sig til specialiserede celletyper kombineret med de seneste fremskridt i genom-redigering teknologier, herunder CRISPR/Cas-system har givet yderligere muligheder for at skræddersy genomet af iPSC for forskellige applikationer herunder sygdom modellering, genterapi, og påvirke overførselsveje differentiering, at nævne nogle få. Blandt de tilgængelige redigering teknologier fremstod CRISPR/Cas9 fra Streptococcus pyogenes som et værktøj til lokationsspecifikke redigering af de eukaryote genom. CRISPRs er let tilgængelige, billigt og yderst effektive i engineering målrettede redigeringer. Systemet kræver en Cas9 nukleasen og en guide sekvens (20-mer) specifikke for genomisk målet abutting 3-nukleotid “NGG” protospacer-tilstødende-motiv (PAM) rettet mod Cas9 til den ønskede genomisk locus, sammen med en universal Cas9 bindende tracer () RNA sammen kaldet enkelt guide RNA eller sgRNA). Her præsenterer vi en trinvis protokol for effektiv generation af feeder-uafhængig og fri for fodspor iPSC og beskrive metoder for genom-redigering af iPSC ved hjælp af Cas9 ribonucleoprotein (RNP) komplekser. Den genom-redigering protokol er effektive og kan være let multipleksede af pre-kompleksbindende sgRNAs for mere end ét mål med Cas9 protein og samtidig levere ind i cellerne. Endelig vil beskrive vi en forenklet metode til identifikation og karakterisering af iPSCs med ønskede redigeringer. Tilsammen, forventes de skitserede strategi at strømline generation og redigering af iPSC for mangfoldige programmer.
Introduction
Omprogrammering af humane somatiske celler til pluripotente tilstand af overekspression af omprogrammering faktorer har revolutioneret stamcelleforskning med programmer i sygdom modellering, regenerativ medicin og udvikling af lægemidler. Findes flere ikke-virale omprogrammering metoder til levering af omprogrammering faktorer og generere iPSCs, men processen er labor intensiv og ikke meget effektiv1. De virale metoder, er men effektiv, forbundet med problemer med virus integration og tumorigenisitetsforsøg2,3,4. I dette manuskript rapporterer vi brugen af cytoplasmatisk Sendai virus for at levere omprogrammering faktorer og fodaftryk-fri iPSC linjer, der mangler integration af enhver viral vektor sekvenser i deres genomer5. Sendai virus er et RNA-virus, der er fortyndet ud af cellen cytoplasma ~ 10 passager efter infektion og producerer omprogrammering faktorer i overflod, fører til hurtig og effektiv omprogrammering6,7. Den etablerede iPSCs kan derefter let skiftet til feeder-frit medium at undgå brugen af musen embryonale fibroblaster (MEFs) som feeder celler8.
I denne publikation, ud over skitserer Sendai virus medieret omprogrammering, beskriver vi også en forbedret protokol til redigering af iPSCs, som har potentialet til at levere ubegrænset menneskelige celler med ønskede genetiske modifikationer for forskning. Vi har brugt CRISPR/Cas9 teknologi til ændring af iPSCs, som nu bliver brugt til en bred vifte af applikationer, herunder knock-ins og knockouts, storstilet genomisk sletninger, poolede bibliotek screening for gen opdagelse, gensplejsning af talrige modelorganismer og gen terapi9,10,11. Denne teknik indebærer dannelsen af komplekser af Streptococcus pyogenes-afledte Cas9 nukleasen og 20-mer guide RNA’er, opnå mål anerkendelse via base-parring med genomisk target sekvens støder op til 3′ nukleotid protospacer tilstødende motiv (PAM) sekvens. Cas9 nukleasen inducerer en dobbelt strandede pause ~ 3 nucleotider fra webstedet PAM, som efterfølgende repareret overvejende af ikke-homologe ende sammenføjning (NHEJ) vej fører til indrykninger eller sletninger i rammen åben læsning, og dermed funktionelle knockout af gener12.
Vores forbedrede protokol indeholder detaljer for kultur af human i bugspytkirtlen celler, deres omprogrammering på mitotically deaktiveret musen embryonale fibroblaster (MEFs) til at opnå højere effektivitet af omprogrammering, efterfølgende tilpasning til feeder-fri kultur på Matrigel, karakterisering af etablerede iPSCs, guidede CRISPR RNA design og forberedelse, levering til iPSCs som RNP komplekser, enkelt celle sortering for at generere klonede linjer af redigerede iPSCs, let screening og identifikation af redigeringer, og karakterisering af enkelt celle kloner. Genomisk sletninger blev effektivt genereret i denne undersøgelse af indførelsen af Cas9 protein og to CRISPR sgRNA RNP komplekser til at fremkalde dobbelt strandede pauser (DSBs) og sletning af de mellemliggende segment. Denne metode udnytter om brug af to guides generere sletninger i rammen åben læsning, høj effektivitet af NHEJ fører til lav række kloner at skal være kendetegnet og nem indledende screening af kloner af den automatiserede kapillær elektroforese enhed, fragment analyzer. Disse effektive genom-redigering metoder til at generere menneskelige stamceller-baseret sygdomsmodeller vil snart blive en standard og rutine fremgangsmåde i et laboratorium, stamceller. Endelig, præcise genom-redigering gør det muligt at gå ud over stamcelleforskning sygdom modellering og potentielt kunne hjælpe katalyserer celle-baserede behandlinger.
Protocol
Representative Results
Discussion
Omprogrammering af humane somatiske celler til iPSCs har givet et stort løft til grundlæggende biologi forskning, personlig medicin, sygdom modellering, udvikling af lægemidler og regenerativ medicin16. Mange aktuelle og udbredte metoder til menneskelige iPSC generation kræver brug af virus med risiko for integration i vært genom eller episomal vektorer med lav omprogrammering effektivitet. Her præsenterer vi en effektiv metode til at generere feeder-gratis iPSCs fra pancreas menneskeceller …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Arbejde i laboratoriet blev støttet af postdoc fellowship grant til Dr. Anjali Nandal og sonderende tilskud fra Maryland Stem Cell Research Fund til BT (TEDCO).
Materials
| Sendai viral vectors – CytoTune-iPS 2.0 Kit | Invitrogen | A16517 | Thaw on ice; S No: 1 |
| Trypsin EDTA | Gibco Life Tech | 25300-054 | 0.05%, 100 ml; S No: 2 |
| Rock inhibitor (Y-27632) | Milipore | SCM075 | Use 10 μM; S No: 3 |
| DMEM/F-12 medium | Invitrogen | 11330-032 | S No: 4 |
| Serum replacement (KSR) | Gibco | 10828028 | S No: 5 |
| DMEM | Invitrogen | 11960069 | 1X; S No: 6 |
| Fetal bovine serum | Thermo Scientific | SH30071.03 | Aliquot; S No: 7 |
| L-glutamine (Glutamax, 100X), liquid | Thermo Scientific | 35050061 | 1/100; S No: 8 |
| Non-Essential Amino Acids | Gibco | 11140-050 | 1/100; S No: 9 |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | 55 mM, 1/1,000; S No: 10 |
| Hausser Hemacytometers | Hausser Scientific | 02-671-54 | S No: 11 |
| 0.1% Gelatin Solution | STEMCELL Technologies | 7903 | Incubate at 37º C for 1 hour; S No: 12 |
| SSEA-4 antibody | Santacruz | sc-21704 | 1/100; S No: 13 |
| TRA-1-81 antibody | Cell Signaling | 4745S | 1/200; S No: 14 |
| OCT4 antibody | Santa Cruz | sc-5279 | 1/1,000; S No: 15 |
| Collagen I, Rat Tail | Life Technologies | A10483-01 | Keep cold; S No: 16 |
| Alexa Fluor fluorescent 488/ 568 (secondary antibodies) | Invitrogen | A21202/A10042 | 1/2,000; S No: 17 |
| DPBS | Hyclone | SH30028LS | 1X; S No: 18 |
| 100-mm tissue culture dish | Falcon | 353003 | S No: 20 |
| 96-well tissue culture plate | Falcon | 353078 | S No: 21 |
| 6-well tissue culture plate | Falcon | 353046 | S No: 22 |
| Dissecting scope | Nikon | SMZ745 | S No: 23 |
| Picking hood | NuAire | NU-301 | S No: 24 |
| 15 ml Centrifuge Tube | Greiner Bio-One | 188271 | S No: 25 |
| 50 ml Centrifuge Tube | Greiner Bio-One | 227261 | S No: 26 |
| Sodium pyruvate | Invitrogen | 11360 | S No: 28 |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M7522 | S No: 29 |
| Prigrow III medium | ABM | TM003 | S No: 31 |
| Countess™ Cell Counter | Invitrogen | C10227 | S No: 32 |
| Faxitron X-ray system | Faxitron | CellRad | S No: 33 |
| Accutase | Innovative cell Technologies | AT-104 | S No: 34 |
| Collagenase | Life Technologies | 17104019 | 1mg/ml stock; S No: 35 |
| Dispase | STEMCELL Technologies | 7923 | S No: 36 |
| hESC qualified matrigel | BD Biosciences | 354277 | To dilute, use cold DMEM/F-12; S No: 37 |
| bFGF | R & D | 233-FB | Stock 10 ug/ml; S No: 38 |
| Paraformaldehyde | EMS | 15710 | 4% stock in PBS; S No: 39 |
| TRA-1-60 | Santa Cruz | sc-21705 | 1/100; S No: 40 |
| NANOG | ReproCELL | RCAB0004P-F | 1/100; S No: 41 |
| Tween 20 | Sigma | P9416-100ML | S No: 42 |
| Alkaline Phosphatase kit | Stemgent | 00-0055 | S No: 43 |
| Cas9 protein | PNA Bio | CP01-50 | Thaw and aliquot; S No: 44 |
| Goat or donkey serum | Sigma | D9663/G9023 | S No: 45 |
| Triton X-100 | Sigma | X100-100ML | S No: 46 |
| DAPI | Thermo Scientific | D1306 | S No: 47 |
| Tris | Sigma | 9285-100ML | S No: 48 |
| NaCL | Sigma | S7653-250G | S No: 49 |
| EDTA | Sigma | BP2482-500 | S No: 50 |
| T4 DNA ligase | NEB | M0202T | S No: 51 |
| Mega Shortscript T7 kit | Thermo Scientific | AM1354 | S No: 52 |
| Mega Clear kit | Thermo Scientific | AM1908 | S No: 53 |
| SMC4 | BD Biosciences | 354357 | S No: 54 |
| Fibronectin | STEMCELL Technologies | 7159 | S No: 55 |
| CloneJET cloning kit | Thermo Scientific | K1232 | S No: 56 |
| Fragment analyzerTM | Advanced Analytical | S No: 57 | |
| mTeSR1 medium kit | STEMCELL Technologies | 5850 | Warm to room temperature; S No: 58 |
| Freezing medium mFreSR™ | STEMCELL Technologies | 5855 | S No: 59 |
| Freezing medium CryoStor® | STEMCELL Technologies | 7930 | S No: 60 |
| MEFs | Globalstem | GSC-6301G | S No: 61 |
| L-glutamine | Invitrogen | 25030081 | S No: 62 |
| Human pancreatic cells | ABM | T0159 | S No: 63 |
| STEMdiff™ Neural Induction Medium | Stemcell Technologies | 5835 | S No: 64 |
| RPMI | Thermofisher | 11875-093 | S No: 65 |
| 2% B27-insulin | Thermofisher | A1895601 | S No: 66 |
| CHIR99021 | Stemcell Technologies | 72052 | S No: 67 |
| IWP4 | Stemcell Technologies | 72552 | S No: 68 |
| 2% B27 | Thermofisher | 17504044 | S No: 69 |
| MCDB 131 | Life Technologies | 10372019 | S No: 70 |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S8761-100ML | S No: 71 |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-100G | S No: 72 |
| BSA | Proliant | 68700 | S No: 73 |
| GDF8 | Pepro-Tech | 120-00 | S No: 74 |
| TUJ1 antibody | EMD Milipore | AB9354 | S No: 75 |
| NKX2-5 antibody | Santa Cruz | Sc-14033 | S No: 76 |
| SOX17 antibody | R & D systems | AF1924 | S No: 77 |
| Propidium iodide | Thermo Scientific | P3566 | S No: 78 |
| Amaxa 4D-nucleofector™ | Lonza | AAF-1002 | S No: 79 |
| FACSAria II (cell sorter) | BD biosciences | SORP UV | S No: 80 |
References
- Malik, N., Rao, M. S. A review of the methods for human iPSC derivation. Methods Mol. Biol. 997, 23-33 (2013).
- Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318, 1917-1920 (2007).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
- Sommer, C. A., et al. Induced pluripotent stem cell generation using a single lentiviral stem cell cassette. Stem cells. 27, 543-549 (2009).
- Macarthur, C. C., et al. Generation of human-induced pluripotent stem cells by a nonintegrating RNA Sendai virus vector in feeder-free or xeno-free conditions. Stem cells Int. , 564612 (2012).
- Li, H. O., et al. A cytoplasmic RNA vector derived from nontransmissible Sendai virus with efficient gene transfer and expression. J Virol. 74, 6564-6569 (2000).
- Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome. Proc. Jpn. Acad. Ser. B, PhysBiol. Sci. 85, 348-362 (2009).
- Nakagawa, M., et al. A novel efficient feeder-free culture system for the derivation of human induced pluripotent stem cells. Sci. Rep. 4, 3594 (2014).
- Hockemeyer, D., Jaenisch, R. Induced Pluripotent Stem Cells Meet Genome Editing. Cell stem cell. 18, 573-586 (2016).
- Komor, A. C., Badran, A. H., Liu, D. R. CRISPR-Based Technologies for the Manipulation of Eukaryotic Genomes. Cell. 169, 559 (2017).
- Komor, A. C., Badran, A. H., Liu, D. R. CRISPR-Based Technologies for the Manipulation of Eukaryotic Genomes. Cell. 168, 20-36 (2017).
- Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nat. Biotech. 32, 347-355 (2014).
- McElroy, S. L., Reijo Pera, R. A. Preparation of mouse embryonic fibroblast feeder cells for human embryonic stem cell culture. CSH Protoc. 2008, (2008).
- Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, E1848-E1857 (2012).
- Rezania, A., et al. Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells. Nat. Biotech. 32, 1121-1133 (2014).
- Shi, Y., Inoue, H., Wu, J. C., Yamanaka, S. Induced pluripotent stem cell technology: a decade of progress. Nat. Rev. Drug Discov. 16, 115-130 (2017).
- Wang, B., et al. Highly efficient CRISPR/HDR-mediated knock-in for mouse embryonic stem cells and zygotes. BioTechniques. 59, (2015).
- Liang, X., Potter, J., Kumar, S., Ravinder, N., Chesnut, J. D. Enhanced CRISPR/Cas9-mediated precise genome editing by improved design and delivery of gRNA, Cas9 nuclease, and donor DNA. J Biotech. 241, 136-146 (2017).
