Effiziente Erzeugung und Bearbeitung von Feeder-freie IPSCs aus menschlichen Zellen der Bauchspeicheldrüse mit dem CRISPR-Cas9-System

Summary

Dieses Protokoll beschreibt im Detail die Generation der Fußabdruck-freie induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs) aus menschlichen Zellen der Bauchspeicheldrüse in den Feeder-freien Bedingungen, gefolgt von Bearbeitung mit CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins und Charakterisierung der geänderten einzellige Klone.

Abstract

Embryonalen und induzierte pluripotente Stammzellen können selbst zu erneuern und in mehreren Zelltypen des Körpers differenzieren. Die pluripotenten Zellen sind somit für die Forschung in der regenerativen Medizin begehrt und werden derzeit in klinischen Studien für Augenerkrankungen, Diabetes, Herzkrankheiten und anderen Erkrankungen. Das Potential, sich in spezialisierte Zelltypen, gekoppelt mit der jüngsten Fortschritte im Genom Bearbeitung Technologien einschließlich der CRISPR/Cas-System differenzieren haben zusätzliche Möglichkeiten für die Anpassung des Genoms des iPSC für die verschiedensten Anwendungen zur Verfügung gestellt einschließlich der Krankheit Modellierung, Gentherapie, und Vorspannen Wege der Differenzierung, um nur einige zu nennen. Unter den verfügbaren Bearbeitungen Technologien hat CRISPR/Cas9 von Streptococcus Pyogenes als ein Werkzeug der Wahl für die standortspezifische Bearbeitung des eukaryotischen Genoms entstanden. Das CRISPR sind leicht zugänglich, kostengünstig und höchst effizient in technische gezielte Bearbeitungen. Das System benötigt einen Cas9-Nuklease und ein Führer-Sequenz (20-Mer) spezifisch für die genomische Ziel anschlagenden ein 3-Nukleotid “NGG” Protospacer-neben-Motiv (PAM) für die Ausrichtung der Cas9 auf die gewünschte genomischen Locus, neben einem universellen Cas9 Bindung Tracer RNA ( zusammengerufen einzelne Führer RNS oder SgRNA). Hier präsentieren wir Ihnen eine Schritt-für-Schritt-Protokoll für die effiziente Erzeugung von Feeder-unabhängig und frei von Fußabdruck iPSC und beschreiben Methoden für die Genom-Bearbeitung der iPSC mit Cas9 Ribonucleoprotein (RNP) komplexe. Das Genom Bearbeitung Protokoll ist effektiv und kann leicht durch Pre-Komplexbildner SgRNAs für mehr als ein Ziel mit dem Cas9 Protein und gleichzeitig in die Zellen liefern gemultiplext werden. Schließlich beschreiben wir einen vereinfachten Ansatz zur Identifizierung und Charakterisierung von iPSCs mit gewünschten Bearbeitungen. Zusammengenommen dürften die skizzierten Strategien zur Erzeugung und Bearbeitung von iPSC für vielfältige Anwendungen zu optimieren.

Introduction

Die Neuprogrammierung der menschlichen Körperzellen zu pluripotenten Zustand durch Überexpression der Neuprogrammierung Faktoren hat Stammzellenforschung mit Anwendungen in der Krankheit Modellierung, regenerative Medizin und Arzneimittelentwicklung revolutioniert. Mehrere nicht-viralen Neuprogrammierung Methoden sind lieferbar Umprogrammierung Faktoren und iPSCs zu generieren, aber der Prozess ist Arbeit intensiv und nicht sehr effizient¹. Die virale Methoden sind zwar effizienter, mit Problemen der Virus Integration und Tumorigenität^2,3,4. In diesem Manuskript berichten wir über die Verwendung von zytoplasmatischen Sendai-Virus für liefernde Umprogrammierung Faktoren und iPSC-Fußabdruck-freie Linien, die Integration von einer viralen Vektoren Sequenzen in ihre Genome⁵fehlt. Sendai-Virus ist ein RNA-Virus, wird aus der Zelle Zytoplasma ~ 10 Passagen nach Infektion verdünnt und produziert Neuprogrammierung Faktoren in Hülle und Fülle, führt zu schnellen und effizienten Umprogrammierung^6,7. Die etablierten iPSCs können dann ohne weiteres Feeder-freies Medium zu vermeiden die Verwendung von Maus embryonalen Fibroblasten (MEFs) als Feeder Zellen⁸umgestellt werden.

In dieser Publikation neben umreißt das Sendai-Virus vermittelt Neuprogrammierung erläutern wir im folgenden eine verbesserte Protokoll zur Bearbeitung iPSCs, hat das Potenzial, unbegrenzte menschliche Zellen mit gewünschten genetischen Veränderungen für die Forschung zu liefern. Wir haben CRISPR/Cas9 Technologie zur Modifikation der iPSCs, verwendet, die nun für eine breite Palette von Anwendungen, einschließlich Knock-ins und Knockouts, groß angelegte genomische Deletionen, gepoolte Bibliothek screening für gen-Entdeckung, Gentechnik verwendet wird zahlreiche Modellorganismen, und Gen-Therapie^9,10,11. Diese Technik beinhaltet die Bildung von komplexen von Streptococcus Pyogenes-abgeleitete Cas9 Nuklease und 20-Mer guide RNAs, die Zielerfassung über Basis-Paarung mit genomischen Zielsequenz angrenzend an 3′ Nukleotid Protospacer angrenzenden erreichen Motiv (PAM) Sequenz. Die Cas9-Nuklease induziert eine gestrandete Doppelunterbrechung ~ 3 Nukleotide aus der PAM-Website, die vorwiegend durch nicht-homologe Ende verbinden (NHEJ) Weg Insertionen oder Deletionen in den offenen Leserahmen anschließend repariert und damit funktionsfähig ist Ko von Genen¹².

Unsere verbesserte Protokoll enthält die Details für die Kultur der menschlichen Zellen der Bauchspeicheldrüse, deren Neuprogrammierung auf mitotically inaktiviert Maus embryonalen Fibroblasten (MEFs) höheren Wirkungsgrad der Neuprogrammierung, nachträgliche Anpassung an Feeder-freie Kultur auf Matrigel, Charakterisierung von etablierten iPSCs geführte CRISPR RNA Design und Vorbereitung, Lieferung in iPSCs als RNP-komplexe, einzelne Zelle Sortierung klonale Linien des bearbeiteten iPSCs generieren, einfach screening und Identifizierung von Bearbeitungen und Charakterisierung der einzelne Zelle klont. Genomische Deletionen wurden in dieser Studie effizient erzeugt, durch die Einführung von Cas9 Protein und zwei CRISPR SgRNA RNP komplexe induzieren doppelte gestrandete Pausen (DSB) und segmentieren Sie löschen die einzugreifen. Diese Methode nutzt die Verwendung von zwei Guides zur Erzeugung von Löschungen in den offenen Leserahmen, hohe Leistungsfähigkeit des NHEJ führt zu geringen Anzahl von Klone dieser Notwendigkeit charakterisiert werden und einfache Vorauswahl der Klone durch automatisierte Kapillar Elektrophorese-Einheit, Fragment Analyzer. Diese effektive Genom Bearbeitungsmethoden um menschliche stammzellbasierte Krankheitsmodelle generieren werden bald ein standard und Routine Ansatz in jedem Stammzell-Labor. Zu guter Letzt präzise Genom-Bearbeitung machen es möglich, über Stammzellen Krankheit Modellierung und potenziell könnte helfen, zellbasierte Therapien zu katalysieren.

Protocol

1. Umprogrammierung Protokoll Generation von menschlichen iPSC aus primären menschlichen pankreatischen Zellen Mantel, ein 6-Well-Platte mit 1,5 mg/mL kalte Kollagen und lassen Sie es bei 37 ° C für 1 h Gel, Platte frühe Passage menschliche primäre Zellen der Bauchspeicheldrüse in Prigrow III Medium (~ 1-1,5 × 10 5 Zellen) auf einer Kollagen 6-Well-Platte am Tag-2 beschichtet bis etwa 2,5 × 10 5 Zellen oder mindestens 60 % zu erreichen confluenc…

Representative Results

In dieser Publikation haben wir eine einfache, aber effiziente Protokoll für die Generation der iPSC aus menschlichen Zellen der Bauchspeicheldrüse mit Integration oder Fußabdruck-kostenlose Sendai Virus Vektoren verfolgt. Abbildung 1A zeigt eine schematische Darstellung dieses Neuprogrammierung Protokolls. Die menschlichen Zellen der Bauchspeicheldrüsen waren kommerziell, erworben in Prigrow III Medium kultiviert und ausgestrahlt mit Sendai-Virus wie obe…

Discussion

Umprogrammierung der menschlichen Körperzellen zu iPSCs hat einen wichtigen Impuls für die Felder der Grundlagenbiologie Forschung, personalisierte Medizin, Krankheit Modellierung, Arzneimittelentwicklung und regenerative Medizin¹⁶zur Verfügung gestellt. Viele aktuelle und am weitesten verbreitete Methoden der menschlichen iPSC Generation erfordern den Einsatz von Virus mit dem Risiko einer Integration in das Wirtsgenom oder episomal Vektoren mit geringer Effizienz Umprogrammierung. Hier präse…

Materials

Sendai viral vectors – CytoTune-iPS 2.0 Kit	Invitrogen	A16517	Thaw on ice; S No: 1
Trypsin EDTA	Gibco Life Tech	25300-054	0.05%, 100 ml; S No: 2
Rock inhibitor (Y-27632)	Milipore	SCM075	Use 10 μM; S No: 3
DMEM/F-12 medium	Invitrogen	11330-032	S No: 4
Serum replacement (KSR)	Gibco	10828028	S No: 5
DMEM	Invitrogen	11960069	1X; S No: 6
Fetal bovine serum	Thermo Scientific	SH30071.03	Aliquot; S No: 7
L-glutamine (Glutamax, 100X), liquid	Thermo Scientific	35050061	1/100; S No: 8
Non-Essential Amino Acids	Gibco	11140-050	1/100; S No: 9
2-Mercaptoethanol	Gibco	21985023	55 mM, 1/1,000; S No: 10
Hausser Hemacytometers	Hausser Scientific	02-671-54	S No: 11
0.1% Gelatin Solution	STEMCELL Technologies	7903	Incubate at 37º C for 1 hour; S No: 12
SSEA-4 antibody	Santacruz	sc-21704	1/100; S No: 13
TRA-1-81 antibody	Cell Signaling	4745S	1/200; S No: 14
OCT4 antibody	Santa Cruz	sc-5279	1/1,000; S No: 15
Collagen I, Rat Tail	Life Technologies	A10483-01	Keep cold; S No: 16
Alexa Fluor fluorescent 488/ 568 (secondary antibodies)	Invitrogen	A21202/A10042	1/2,000; S No: 17
DPBS	Hyclone	SH30028LS	1X; S No: 18
100-mm tissue culture dish	Falcon	353003	S No: 20
96-well tissue culture plate	Falcon	353078	S No: 21
6-well tissue culture plate	Falcon	353046	S No: 22
Dissecting scope	Nikon	SMZ745	S No: 23
Picking hood	NuAire	NU-301	S No: 24
15 ml Centrifuge Tube	Greiner Bio-One	188271	S No: 25
50 ml Centrifuge Tube	Greiner Bio-One	227261	S No: 26
Sodium pyruvate	Invitrogen	11360	S No: 28
β-mercaptoethanol	Sigma	M7522	S No: 29
Prigrow III medium	ABM	TM003	S No: 31
Countess™ Cell Counter	Invitrogen	C10227	S No: 32
Faxitron X-ray system	Faxitron	CellRad	S No: 33
Accutase	Innovative cell Technologies	AT-104	S No: 34
Collagenase	Life Technologies	17104019	1mg/ml stock; S No: 35
Dispase	STEMCELL Technologies	7923	S No: 36
hESC qualified matrigel	BD Biosciences	354277	To dilute, use cold DMEM/F-12; S No: 37
bFGF	R & D	233-FB	Stock 10 ug/ml; S No: 38
Paraformaldehyde	EMS	15710	4% stock in PBS; S No: 39
TRA-1-60	Santa Cruz	sc-21705	1/100; S No: 40
NANOG	ReproCELL	RCAB0004P-F	1/100; S No: 41
Tween 20	Sigma	P9416-100ML	S No: 42
Alkaline Phosphatase kit	Stemgent	00-0055	S No: 43
Cas9 protein	PNA Bio	CP01-50	Thaw and aliquot; S No: 44
Goat or donkey serum	Sigma	D9663/G9023	S No: 45
Triton X-100	Sigma	X100-100ML	S No: 46
DAPI	Thermo Scientific	D1306	S No: 47
Tris	Sigma	9285-100ML	S No: 48
NaCL	Sigma	S7653-250G	S No: 49
EDTA	Sigma	BP2482-500	S No: 50
T4 DNA ligase	NEB	M0202T	S No: 51
Mega Shortscript T7 kit	Thermo Scientific	AM1354	S No: 52
Mega Clear kit	Thermo Scientific	AM1908	S No: 53
SMC4	BD Biosciences	354357	S No: 54
Fibronectin	STEMCELL Technologies	7159	S No: 55
CloneJET cloning kit	Thermo Scientific	K1232	S No: 56
Fragment analyzerTM	Advanced Analytical		S No: 57
mTeSR1 medium kit	STEMCELL Technologies	5850	Warm to room temperature; S No: 58
Freezing medium mFreSR™	STEMCELL Technologies	5855	S No: 59
Freezing medium CryoStor®	STEMCELL Technologies	7930	S No: 60
MEFs	Globalstem	GSC-6301G	S No: 61
L-glutamine	Invitrogen	25030081	S No: 62
Human pancreatic cells	ABM	T0159	S No: 63
STEMdiff™ Neural Induction Medium	Stemcell Technologies	5835	S No: 64
RPMI	Thermofisher	11875-093	S No: 65
2% B27-insulin	Thermofisher	A1895601	S No: 66
CHIR99021	Stemcell Technologies	72052	S No: 67
IWP4	Stemcell Technologies	72552	S No: 68
2% B27	Thermofisher	17504044	S No: 69
MCDB 131	Life Technologies	10372019	S No: 70
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S8761-100ML	S No: 71
Glucose	Sigma-Aldrich	G8270-100G	S No: 72
BSA	Proliant	68700	S No: 73
GDF8	Pepro-Tech	120-00	S No: 74
TUJ1 antibody	EMD Milipore	AB9354	S No: 75
NKX2-5 antibody	Santa Cruz	Sc-14033	S No: 76
SOX17 antibody	R & D systems	AF1924	S No: 77
Propidium iodide	Thermo Scientific	P3566	S No: 78
Amaxa 4D-nucleofector™	Lonza	AAF-1002	S No: 79
FACSAria II (cell sorter)	BD biosciences	SORP UV	S No: 80