Verimli üretimi ve besleyici-Alerjik IPSCs CRISPR-Cas9 sistemini kullanarak insan pankreas hücreleri düzenleme
Summary
Bu iletişim kuralı koşullarda besleyici içermeyen insan pankreas hücreleri ayak izi-Alerjik İndüklenmiş pluripotent kök hücreler (iPSCs) nesil ayrıntılı olarak anlatılmaktadır kullanarak CRISPR/Cas9 ribonucleoproteins ve değiştirilmiş karakterizasyonu düzenleyerek takip tek hücre klonlar.
Abstract
Embriyonik ve İndüklenmiş pluripotent kök hücreler kendini yenilemek ve vücudun birden çok hücre tipleri ayırt etmek. Pluripotent hücreler böylece rejeneratif tıp araştırmaları açgözlü ve şu anda göz hastalıkları, diyabet, kalp hastalıkları ve diğer hastalıklar için klinik denemeler vardır. Özel hücre tipleri teknolojik CRISPR/CA sistem dahil düzenleme genom son gelişmeler ile birleştiğinde içine ayırt potansiyeline sahip olmanız koşuluyla IPSC çeşitli uygulamalar için genom dikme için ek fırsatlar modelleme, gen tedavisi ve birkaç isim ayırt etme, yollar kutuplama hastalığı da dahil olmak üzere. Kullanılabilir düzenleme teknolojileri arasında CRISPR/Cas9 Streptococcus pyogenes üzerinden siteye özgü ökaryotik genomu düzenlemek için Seçim aracı olarak ortaya çıkmıştır. CRISPRs kolayca erişilebilir, ucuz ve yüksek verimli hedeflenen düzenlemeleri mühendislik. Cas9 nükleaz ve bir rehber sıralaması (20-mer) belirli bir 3-nükleotit “NGG” protospacer-bitişik-Cas9 evrensel bir Cas9 bağlama izleyici RNA (yanında istenen genomik locus hedefleme için motif (PAM) bitişik genomik hedef sistem gerektirir birlikte tek Kılavuzu RNA ya da sgRNA olarak bilinir). Burada adım adım mevcut protokol besleyici bağımsız ve ayak izi-Alerjik IPSC verimli üretimi için ve genom Cas9 Ribonükleoprotein (RNP) kompleksleri kullanarak IPSC düzenleme yöntemleri açıklanmaktadır. İletişim kuralı düzenleme genom etkilidir ve kolayca Cas9 protein ve aynı anda hücrelere teslim ile birden fazla hedef için pre-kompleks sgRNAs tarafından multiplexed. Son olarak, kimlik ve iPSCs istediğiniz düzenlemeleri ile karakterizasyonu için basitleştirilmiş bir yaklaşım açıklar. Birlikte ele alındığında, Seviyelendirilmiş stratejileri üretimi ve IPSC manifold uygulamalar için düzenlemeyi kolaylaştırmak için bekleniyor.
Introduction
İnsan somatik hücreler pluripotent durumuna reprogramming faktörler yeniden programlama overexpression tarafından kök hücre araştırma hastalığı modelleme, rejeneratif tıp ve ilaç geliştirme uygulamaları ile devrim yarattı. Birkaç viral sigara programlama yöntem faktörler yeniden programlama ve iPSCs üreten teslimat için kullanılabilir, ancak emek yoğun ve çok verimli değil1işlemidir. Viral yöntemleri etkili olsa da, virüs entegrasyon ve tumorigenicity2,3,4sorunlar ile ilişkilidir. Bu makale, sitoplazmik Sendai virüs kullanımı sağlayan faktörler yeniden programlama ve entegrasyon içine onların genleri5herhangi bir viral vektör sıralarının eksikliği IPSC ayak izi içermeyen satırları oluşturmak için rapor. Sendai virüs hücre sitoplazma ~ 10 pasajlar dışarı enfeksiyon sonra seyreltilmiş ve bolluk, hızlı ve verimli6,7yeniden programlama programlama faktörler üreten bir RNA virüsüdür. Kurulan iPSCs sonra kolayca besleyici hücreler8olarak fare embriyonik fibroblastlar (MEFs) kullanımı önlemek için orta besleyici ücretsiz geçiş.
Bu yayındaki Sendai aracılı yeniden programlama, virüs özetleyen ek olarak Ayrıca araştırma için istenen genetik değişiklikler ile sınırsız insan hücreleri tedarik potansiyeline sahiptir iPSCs düzenlemek için gelişmiş bir iletişim kuralı açıklar. Şimdi knock-ins ve altını gizleme, büyük ölçekli genomik silme, havuza alınan Kütüphane gen bulma, genetik mühendisliği için tarama dahil olmak üzere uygulamaların geniş bir yelpazesi için kullanılan iPSCs, değişiklik için CRISPR/Cas9 teknoloji kullanılmıştır çok sayıda model organizmalar ve gen terapisi9,10,11. Streptococcus pyogeneskompleksleri oluşumu bu tekniği içerir-Kılavuzu genomik hedef sıra 3′ nükleotit protospacer için bitişik bitişik hedef tanıma baz eşleşmesi yoluyla elde RNA’ların türetilmiş Cas9 nükleaz ve 20-mer motif (PAM) sıra. Cas9 nükleaz yanında (NHEJ) yolu eklemelerin veya silmelerin açık okuma çerçevesi içinde önde gelen katılmadan homolog son-ağırlıklı olarak daha sonra tamir ve böylece işlevsel PAM sitesinden bir çift telli ara ~ 3 nükleotid neden olmaktadır. nakavt genler12.
Bizim geliştirilmiş iletişim kuralı kültür insan pankreas hücrelerinin ayrıntılarını içerir, onların üzerinde mitotically yeniden programlama inaktive fare embriyonik fibroblastlar yeniden programlama, besleyici-Alerjik kültür sonraki adaptasyon, daha yüksek verim elde etmek için (MEFs) Matrigel kurulan iPSCs, karakterizasyonu CRISPR destekli RNA tasarım ve hazırlık, RNP kompleksleri, tek hücre düzenlenen iPSCs klonal satırları oluşturmak için sıralama, kolay tarama ve düzenlemeleri tanımlaması ve karakterizasyonu olarak iPSCs içine teslim tek hücre klonlar. Genomik silme işlemlerini verimli bir şekilde bu çalışmada Cas9 protein ve iki CRISPR sgRNA RNP kompleksleri çift telli sonları (DSBs) ikna etmek için giriş tarafından üretilen ve müdahalede silme segmentlere ayırmak. Bu yöntem silme açık okuma çerçevesi oluşturmak için iki kılavuzları kullanımı capitalizes, yüksek verim için az sayıda önde gelen NHEJ, o lüzum-e doğru karakterize edilebilir ve kolay ön elemeyi klonların klonlar tarafından otomatik kılcal Elektroforez birimi, parça Çözümleyicisi. İnsan kök hücre tabanlı hastalık modelleri oluşturmak için yöntemleri düzenleme bu etkili genom yakında herhangi bir kök hücre laboratuvar standart ve rutin bir yaklaşım olacaktır. Son olarak, kesin genom düzenleme kök hücre hastalığı modelleme ötesine gitmek mümkün kılacak ve potansiyel hücre tabanlı terapiler katalizler yardımcı.
Protocol
Representative Results
Discussion
İnsan somatik hücre iPSCs için yeniden programlama temel Biyoloji Araştırma, kişiselleştirilmiş tıp, hastalık modelleme, ilaç geliştirme ve rejeneratif tıp16alanlarında önemli bir destek sağlamıştır. Virüs ana bilgisayar genom entegrasyon riski olan insan IPSC üretimi birçok mevcut ve yaygın olarak kullanılan yöntem kullanması veya verimliliği yeniden programlama episomal Vektörler ile düşük. Burada, besleyici-Alerjik iPSCs ‘ayak izi ücretsiz’ ve verimli yeniden pro…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Laboratuvar çalışmalarında Dr Anjali Nandal için doktora sonrası bursu grant ve keşif grant tarafından desteklenen Maryland kök hücre araştırma fonu için BT (TEDCO).
Materials
| Sendai viral vectors – CytoTune-iPS 2.0 Kit | Invitrogen | A16517 | Thaw on ice; S No: 1 |
| Trypsin EDTA | Gibco Life Tech | 25300-054 | 0.05%, 100 ml; S No: 2 |
| Rock inhibitor (Y-27632) | Milipore | SCM075 | Use 10 μM; S No: 3 |
| DMEM/F-12 medium | Invitrogen | 11330-032 | S No: 4 |
| Serum replacement (KSR) | Gibco | 10828028 | S No: 5 |
| DMEM | Invitrogen | 11960069 | 1X; S No: 6 |
| Fetal bovine serum | Thermo Scientific | SH30071.03 | Aliquot; S No: 7 |
| L-glutamine (Glutamax, 100X), liquid | Thermo Scientific | 35050061 | 1/100; S No: 8 |
| Non-Essential Amino Acids | Gibco | 11140-050 | 1/100; S No: 9 |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | 55 mM, 1/1,000; S No: 10 |
| Hausser Hemacytometers | Hausser Scientific | 02-671-54 | S No: 11 |
| 0.1% Gelatin Solution | STEMCELL Technologies | 7903 | Incubate at 37º C for 1 hour; S No: 12 |
| SSEA-4 antibody | Santacruz | sc-21704 | 1/100; S No: 13 |
| TRA-1-81 antibody | Cell Signaling | 4745S | 1/200; S No: 14 |
| OCT4 antibody | Santa Cruz | sc-5279 | 1/1,000; S No: 15 |
| Collagen I, Rat Tail | Life Technologies | A10483-01 | Keep cold; S No: 16 |
| Alexa Fluor fluorescent 488/ 568 (secondary antibodies) | Invitrogen | A21202/A10042 | 1/2,000; S No: 17 |
| DPBS | Hyclone | SH30028LS | 1X; S No: 18 |
| 100-mm tissue culture dish | Falcon | 353003 | S No: 20 |
| 96-well tissue culture plate | Falcon | 353078 | S No: 21 |
| 6-well tissue culture plate | Falcon | 353046 | S No: 22 |
| Dissecting scope | Nikon | SMZ745 | S No: 23 |
| Picking hood | NuAire | NU-301 | S No: 24 |
| 15 ml Centrifuge Tube | Greiner Bio-One | 188271 | S No: 25 |
| 50 ml Centrifuge Tube | Greiner Bio-One | 227261 | S No: 26 |
| Sodium pyruvate | Invitrogen | 11360 | S No: 28 |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M7522 | S No: 29 |
| Prigrow III medium | ABM | TM003 | S No: 31 |
| Countess™ Cell Counter | Invitrogen | C10227 | S No: 32 |
| Faxitron X-ray system | Faxitron | CellRad | S No: 33 |
| Accutase | Innovative cell Technologies | AT-104 | S No: 34 |
| Collagenase | Life Technologies | 17104019 | 1mg/ml stock; S No: 35 |
| Dispase | STEMCELL Technologies | 7923 | S No: 36 |
| hESC qualified matrigel | BD Biosciences | 354277 | To dilute, use cold DMEM/F-12; S No: 37 |
| bFGF | R & D | 233-FB | Stock 10 ug/ml; S No: 38 |
| Paraformaldehyde | EMS | 15710 | 4% stock in PBS; S No: 39 |
| TRA-1-60 | Santa Cruz | sc-21705 | 1/100; S No: 40 |
| NANOG | ReproCELL | RCAB0004P-F | 1/100; S No: 41 |
| Tween 20 | Sigma | P9416-100ML | S No: 42 |
| Alkaline Phosphatase kit | Stemgent | 00-0055 | S No: 43 |
| Cas9 protein | PNA Bio | CP01-50 | Thaw and aliquot; S No: 44 |
| Goat or donkey serum | Sigma | D9663/G9023 | S No: 45 |
| Triton X-100 | Sigma | X100-100ML | S No: 46 |
| DAPI | Thermo Scientific | D1306 | S No: 47 |
| Tris | Sigma | 9285-100ML | S No: 48 |
| NaCL | Sigma | S7653-250G | S No: 49 |
| EDTA | Sigma | BP2482-500 | S No: 50 |
| T4 DNA ligase | NEB | M0202T | S No: 51 |
| Mega Shortscript T7 kit | Thermo Scientific | AM1354 | S No: 52 |
| Mega Clear kit | Thermo Scientific | AM1908 | S No: 53 |
| SMC4 | BD Biosciences | 354357 | S No: 54 |
| Fibronectin | STEMCELL Technologies | 7159 | S No: 55 |
| CloneJET cloning kit | Thermo Scientific | K1232 | S No: 56 |
| Fragment analyzerTM | Advanced Analytical | S No: 57 | |
| mTeSR1 medium kit | STEMCELL Technologies | 5850 | Warm to room temperature; S No: 58 |
| Freezing medium mFreSR™ | STEMCELL Technologies | 5855 | S No: 59 |
| Freezing medium CryoStor® | STEMCELL Technologies | 7930 | S No: 60 |
| MEFs | Globalstem | GSC-6301G | S No: 61 |
| L-glutamine | Invitrogen | 25030081 | S No: 62 |
| Human pancreatic cells | ABM | T0159 | S No: 63 |
| STEMdiff™ Neural Induction Medium | Stemcell Technologies | 5835 | S No: 64 |
| RPMI | Thermofisher | 11875-093 | S No: 65 |
| 2% B27-insulin | Thermofisher | A1895601 | S No: 66 |
| CHIR99021 | Stemcell Technologies | 72052 | S No: 67 |
| IWP4 | Stemcell Technologies | 72552 | S No: 68 |
| 2% B27 | Thermofisher | 17504044 | S No: 69 |
| MCDB 131 | Life Technologies | 10372019 | S No: 70 |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S8761-100ML | S No: 71 |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-100G | S No: 72 |
| BSA | Proliant | 68700 | S No: 73 |
| GDF8 | Pepro-Tech | 120-00 | S No: 74 |
| TUJ1 antibody | EMD Milipore | AB9354 | S No: 75 |
| NKX2-5 antibody | Santa Cruz | Sc-14033 | S No: 76 |
| SOX17 antibody | R & D systems | AF1924 | S No: 77 |
| Propidium iodide | Thermo Scientific | P3566 | S No: 78 |
| Amaxa 4D-nucleofector™ | Lonza | AAF-1002 | S No: 79 |
| FACSAria II (cell sorter) | BD biosciences | SORP UV | S No: 80 |
References
- Malik, N., Rao, M. S. A review of the methods for human iPSC derivation. Methods Mol. Biol. 997, 23-33 (2013).
- Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318, 1917-1920 (2007).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
- Sommer, C. A., et al. Induced pluripotent stem cell generation using a single lentiviral stem cell cassette. Stem cells. 27, 543-549 (2009).
- Macarthur, C. C., et al. Generation of human-induced pluripotent stem cells by a nonintegrating RNA Sendai virus vector in feeder-free or xeno-free conditions. Stem cells Int. , 564612 (2012).
- Li, H. O., et al. A cytoplasmic RNA vector derived from nontransmissible Sendai virus with efficient gene transfer and expression. J Virol. 74, 6564-6569 (2000).
- Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome. Proc. Jpn. Acad. Ser. B, PhysBiol. Sci. 85, 348-362 (2009).
- Nakagawa, M., et al. A novel efficient feeder-free culture system for the derivation of human induced pluripotent stem cells. Sci. Rep. 4, 3594 (2014).
- Hockemeyer, D., Jaenisch, R. Induced Pluripotent Stem Cells Meet Genome Editing. Cell stem cell. 18, 573-586 (2016).
- Komor, A. C., Badran, A. H., Liu, D. R. CRISPR-Based Technologies for the Manipulation of Eukaryotic Genomes. Cell. 169, 559 (2017).
- Komor, A. C., Badran, A. H., Liu, D. R. CRISPR-Based Technologies for the Manipulation of Eukaryotic Genomes. Cell. 168, 20-36 (2017).
- Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nat. Biotech. 32, 347-355 (2014).
- McElroy, S. L., Reijo Pera, R. A. Preparation of mouse embryonic fibroblast feeder cells for human embryonic stem cell culture. CSH Protoc. 2008, (2008).
- Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, E1848-E1857 (2012).
- Rezania, A., et al. Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells. Nat. Biotech. 32, 1121-1133 (2014).
- Shi, Y., Inoue, H., Wu, J. C., Yamanaka, S. Induced pluripotent stem cell technology: a decade of progress. Nat. Rev. Drug Discov. 16, 115-130 (2017).
- Wang, B., et al. Highly efficient CRISPR/HDR-mediated knock-in for mouse embryonic stem cells and zygotes. BioTechniques. 59, (2015).
- Liang, X., Potter, J., Kumar, S., Ravinder, N., Chesnut, J. D. Enhanced CRISPR/Cas9-mediated precise genome editing by improved design and delivery of gRNA, Cas9 nuclease, and donor DNA. J Biotech. 241, 136-146 (2017).
