Efficiënte generatie en het bewerken van Feeder-vrije IPSCs van menselijke Pancreatic cellen met behulp van de CRISPR-Cas9-systeem
Summary
Dit protocol beschrijft in detail de generatie van voetafdruk-vrije geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) van menselijke pancreatic cellen onder feeder-vrije, gevolgd door bewerken met behulp van CRISPR/Cas9 ribonucleoproteins en karakterisering van de gewijzigde eencellige klonen.
Abstract
Embryonale en geïnduceerde pluripotente stamcellen kan zichzelf vernieuwen en onderscheid maken in meerdere celtypes van het lichaam. De pluripotente cellen zijn dus begeerde voor onderzoek in de regeneratieve geneeskunde en zijn momenteel in klinische proeven voor oogziekten, diabetes, hart-en vaatziekten en andere aandoeningen. Het potentieel om te differentiëren tot gespecialiseerde celtypen in combinatie met de recente vooruitgang in genoom bewerken van technologieën met inbegrip van de CRISPR/Cas systeem bieden extra mogelijkheden voor het afstemmen van het genoom van iPSC voor gevarieerde toepassingen met inbegrip van ziekte modellering, gentherapie, en vertekenende trajecten van differentiatie, om enkelen te noemen. Onder de beschikbare bewerken technologieën, heeft de CRISPR/Cas9 van Streptococcus pyogenes ontpopt als een instrument van keuze voor specifieke bewerking van het eukaryotische genoom. De CRISPRs zijn gemakkelijk te bereiken, goedkope en zeer efficiënte in de techniek gerichte bewerkingen. Het systeem vereist een nuclease Cas9 en een reeks van de gids (20-mer) specifieke aan de genomic doelgroep een 3-nucleotide “NGG” protospacer-aangrenzende-motief (PAM) voor het targeten van Cas9 naar de gewenste genomic locus, naast een universele Cas9 bindende tracer RNA (aangrenzende samen één gids RNA of genoemd sgRNA). Hier presenteren we een stapsgewijze protocol voor efficiënte generatie feeder-onafhankelijke en voetafdruk-vrije iPSC en beschrijven van methoden voor het bewerken van het genoom van iPSC met behulp van de Cas9 ribonucleoprotein (RNP) complexen. Het genoom bewerken protocol is effectief en gemakkelijk kan worden multiplexed door pre-complexvormers sgRNAs voor meer dan één streefniveau met het Cas9 eiwit en tegelijkertijd leveren in de cellen. Ten slotte, beschrijven we een vereenvoudigde benadering voor de identificatie en karakterisering van iPSCs met gewenste bewerkingen. De geschetste strategieën tezamen, verwachting rendering en bewerken van iPSC voor vele toepassingen stroomlijnen.
Introduction
De herprogrammering van menselijke lichaamscellen aan de pluripotente staat door overexpressie van herprogrammering van factoren heeft een revolutie teweeggebracht in stamcelonderzoek met toepassingen in ziekte modellering, regeneratieve geneeskunde en Geneesmiddelenontwikkeling. Verschillende niet-virale herprogrammering methoden zijn beschikbaar voor levering van herprogrammering factoren en het genereren van iPSCs, maar het proces is arbeid intensieve en niet zeer efficiënte1. De virale methoden, zijn hoewel efficiënt, geassocieerd met problemen van de integratie van het virus en tumorigeniciteit2,3,4. In dit manuscript rapporteren we het gebruik van cytoplasmatische Sendai virus voor leveren herprogrammering van factoren en tot oprichting van iPSC voetafdruk-vrije lijnen dat het gebrek aan integratie van alle virale vector sequenties in hun genoom5. Sendai virus is een RNA-virus dat na infectie uit cel cytoplasma ~ 10 passages wordt verdund en produceert herprogrammering factoren in overvloed, wat leidt tot snelle en efficiënte herprogrammering van6,7. De gevestigde iPSCs kunnen dan gemakkelijk worden overgestapt naar feeder-gratis medium om te voorkomen dat het gebruik van muis embryonale fibroblasten (MEFs) als feeder cellen8.
In deze publicatie, naast het overzicht van het virus van de Sendai gemedieerde herprogrammering, beschrijven we ook een verbeterde protocol voor het bewerken van iPSCs, die het potentieel heeft om het verstrekken van onbeperkt menselijke cellen met de gewenste genetische modificaties voor onderzoek. Wij hebben CRISPR/Cas9 technologie gebruikt voor de wijziging van de iPSCs, die nu wordt gebruikt voor een breed scala aan toepassingen waaronder knock-ins en uitsparingen, grootschalige genomic deleties, gebundelde bibliotheek screening voor gene discovery, genetische manipulatie van talrijke modelorganismen, en gene therapie9,10,11. Deze techniek gaat de vorming van complexen van Streptococcus pyogenes-afgeleide Cas9 nuclease en 20-mer gids RNAs dat doel erkenning via base-paring met genomic doel opeenvolging grenzend aan 3′ nucleotide protospacer aangrenzende bereiken motief (PAM) volgorde. De Cas9 nuclease induceert een dubbele gestrande onderbreking ~ 3 nucleotiden uit de PAM-site, die vervolgens gerepareerde overwegend door niet-homologe einde (NHEJ) traject leidt tot invoegingen of verwijderingen in de open leesraam toetreden, en daardoor functionele Knockout van genen12.
Onze verbeterde protocol bevat de details voor cultuur van menselijke cellen van de alvleesklier, hun herprogrammering op mitotically geïnactiveerd muis embryonale fibroblasten (MEFs) om hogere efficiëntie te herprogrammeren, latere aanpassing aan de feeder-vrije cultuur op Matrigel, karakterisering van gevestigde iPSCs, begeleide CRISPR RNA ontwerp en voorbereiding, levering in iPSCs als RNP complexen, eencellige sorteren als u wilt klonen van bewerkte iPSCs genereren, gemakkelijk screening en identificatie van bewerkingen en karakterisering van eencellige klonen. Genomic verwijderingen werden efficiënt gegenereerd in deze studie door de invoering van Cas9 eiwit en twee CRISPR sgRNA RNP complexen voor het opwekken van dubbele gestrande einden (DSBs) en verwijdering van de tussenliggende segment. Deze methode speelt in op het gebruik van twee gidsen voor het genereren van verwijderingen in de open leesraam, hoog rendement van NHEJ leidt tot lage aantal klonen dat moet worden gekenmerkt en gemakkelijk oriënterende van klonen door het geautomatiseerde capillair elektroforese eenheid, fragment analyzer. Deze effectieve genoom bewerkingsmethoden voor het genereren van ziekten bij de mens stamcel gebaseerde modellen zal binnenkort een standaard en routinematige benadering in elke cel van de stam-laboratorium. Tenslotte precieze genoom bewerken zal het mogelijk maken te gaan dan stamcel ziekte modellering en potentieel kunnen katalyseren van cel-gebaseerde therapieën.
Protocol
Representative Results
Discussion
Herprogrammering van menselijke lichaamscellen te iPSCs, heeft een belangrijke impuls aan het gebied van de fundamentele biologie onderzoek, gepersonaliseerde geneeskunde, ziekte modellering, Geneesmiddelenontwikkeling en regeneratieve geneeskunde16verstrekt. Veel huidige en meest gebruikte methoden van menselijke iPSC generatie vereisen het gebruik van virus met het risico van integratie in het genoom van de host of episomal vectoren met lage herprogrammering van efficiëntie. Hier presenteren we…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Werk in het lab werd ondersteund door de toekenning van de postdoctorale fellowship aan Dr. Anjali Nandal en verkennende subsidie uit Maryland Fonds voor de onderzoek van de stamcel naar BT (TEDCO).
Materials
| Sendai viral vectors – CytoTune-iPS 2.0 Kit | Invitrogen | A16517 | Thaw on ice; S No: 1 |
| Trypsin EDTA | Gibco Life Tech | 25300-054 | 0.05%, 100 ml; S No: 2 |
| Rock inhibitor (Y-27632) | Milipore | SCM075 | Use 10 μM; S No: 3 |
| DMEM/F-12 medium | Invitrogen | 11330-032 | S No: 4 |
| Serum replacement (KSR) | Gibco | 10828028 | S No: 5 |
| DMEM | Invitrogen | 11960069 | 1X; S No: 6 |
| Fetal bovine serum | Thermo Scientific | SH30071.03 | Aliquot; S No: 7 |
| L-glutamine (Glutamax, 100X), liquid | Thermo Scientific | 35050061 | 1/100; S No: 8 |
| Non-Essential Amino Acids | Gibco | 11140-050 | 1/100; S No: 9 |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | 55 mM, 1/1,000; S No: 10 |
| Hausser Hemacytometers | Hausser Scientific | 02-671-54 | S No: 11 |
| 0.1% Gelatin Solution | STEMCELL Technologies | 7903 | Incubate at 37º C for 1 hour; S No: 12 |
| SSEA-4 antibody | Santacruz | sc-21704 | 1/100; S No: 13 |
| TRA-1-81 antibody | Cell Signaling | 4745S | 1/200; S No: 14 |
| OCT4 antibody | Santa Cruz | sc-5279 | 1/1,000; S No: 15 |
| Collagen I, Rat Tail | Life Technologies | A10483-01 | Keep cold; S No: 16 |
| Alexa Fluor fluorescent 488/ 568 (secondary antibodies) | Invitrogen | A21202/A10042 | 1/2,000; S No: 17 |
| DPBS | Hyclone | SH30028LS | 1X; S No: 18 |
| 100-mm tissue culture dish | Falcon | 353003 | S No: 20 |
| 96-well tissue culture plate | Falcon | 353078 | S No: 21 |
| 6-well tissue culture plate | Falcon | 353046 | S No: 22 |
| Dissecting scope | Nikon | SMZ745 | S No: 23 |
| Picking hood | NuAire | NU-301 | S No: 24 |
| 15 ml Centrifuge Tube | Greiner Bio-One | 188271 | S No: 25 |
| 50 ml Centrifuge Tube | Greiner Bio-One | 227261 | S No: 26 |
| Sodium pyruvate | Invitrogen | 11360 | S No: 28 |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M7522 | S No: 29 |
| Prigrow III medium | ABM | TM003 | S No: 31 |
| Countess™ Cell Counter | Invitrogen | C10227 | S No: 32 |
| Faxitron X-ray system | Faxitron | CellRad | S No: 33 |
| Accutase | Innovative cell Technologies | AT-104 | S No: 34 |
| Collagenase | Life Technologies | 17104019 | 1mg/ml stock; S No: 35 |
| Dispase | STEMCELL Technologies | 7923 | S No: 36 |
| hESC qualified matrigel | BD Biosciences | 354277 | To dilute, use cold DMEM/F-12; S No: 37 |
| bFGF | R & D | 233-FB | Stock 10 ug/ml; S No: 38 |
| Paraformaldehyde | EMS | 15710 | 4% stock in PBS; S No: 39 |
| TRA-1-60 | Santa Cruz | sc-21705 | 1/100; S No: 40 |
| NANOG | ReproCELL | RCAB0004P-F | 1/100; S No: 41 |
| Tween 20 | Sigma | P9416-100ML | S No: 42 |
| Alkaline Phosphatase kit | Stemgent | 00-0055 | S No: 43 |
| Cas9 protein | PNA Bio | CP01-50 | Thaw and aliquot; S No: 44 |
| Goat or donkey serum | Sigma | D9663/G9023 | S No: 45 |
| Triton X-100 | Sigma | X100-100ML | S No: 46 |
| DAPI | Thermo Scientific | D1306 | S No: 47 |
| Tris | Sigma | 9285-100ML | S No: 48 |
| NaCL | Sigma | S7653-250G | S No: 49 |
| EDTA | Sigma | BP2482-500 | S No: 50 |
| T4 DNA ligase | NEB | M0202T | S No: 51 |
| Mega Shortscript T7 kit | Thermo Scientific | AM1354 | S No: 52 |
| Mega Clear kit | Thermo Scientific | AM1908 | S No: 53 |
| SMC4 | BD Biosciences | 354357 | S No: 54 |
| Fibronectin | STEMCELL Technologies | 7159 | S No: 55 |
| CloneJET cloning kit | Thermo Scientific | K1232 | S No: 56 |
| Fragment analyzerTM | Advanced Analytical | S No: 57 | |
| mTeSR1 medium kit | STEMCELL Technologies | 5850 | Warm to room temperature; S No: 58 |
| Freezing medium mFreSR™ | STEMCELL Technologies | 5855 | S No: 59 |
| Freezing medium CryoStor® | STEMCELL Technologies | 7930 | S No: 60 |
| MEFs | Globalstem | GSC-6301G | S No: 61 |
| L-glutamine | Invitrogen | 25030081 | S No: 62 |
| Human pancreatic cells | ABM | T0159 | S No: 63 |
| STEMdiff™ Neural Induction Medium | Stemcell Technologies | 5835 | S No: 64 |
| RPMI | Thermofisher | 11875-093 | S No: 65 |
| 2% B27-insulin | Thermofisher | A1895601 | S No: 66 |
| CHIR99021 | Stemcell Technologies | 72052 | S No: 67 |
| IWP4 | Stemcell Technologies | 72552 | S No: 68 |
| 2% B27 | Thermofisher | 17504044 | S No: 69 |
| MCDB 131 | Life Technologies | 10372019 | S No: 70 |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S8761-100ML | S No: 71 |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-100G | S No: 72 |
| BSA | Proliant | 68700 | S No: 73 |
| GDF8 | Pepro-Tech | 120-00 | S No: 74 |
| TUJ1 antibody | EMD Milipore | AB9354 | S No: 75 |
| NKX2-5 antibody | Santa Cruz | Sc-14033 | S No: 76 |
| SOX17 antibody | R & D systems | AF1924 | S No: 77 |
| Propidium iodide | Thermo Scientific | P3566 | S No: 78 |
| Amaxa 4D-nucleofector™ | Lonza | AAF-1002 | S No: 79 |
| FACSAria II (cell sorter) | BD biosciences | SORP UV | S No: 80 |
References
- Malik, N., Rao, M. S. A review of the methods for human iPSC derivation. Methods Mol. Biol. 997, 23-33 (2013).
- Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318, 1917-1920 (2007).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
- Sommer, C. A., et al. Induced pluripotent stem cell generation using a single lentiviral stem cell cassette. Stem cells. 27, 543-549 (2009).
- Macarthur, C. C., et al. Generation of human-induced pluripotent stem cells by a nonintegrating RNA Sendai virus vector in feeder-free or xeno-free conditions. Stem cells Int. , 564612 (2012).
- Li, H. O., et al. A cytoplasmic RNA vector derived from nontransmissible Sendai virus with efficient gene transfer and expression. J Virol. 74, 6564-6569 (2000).
- Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome. Proc. Jpn. Acad. Ser. B, PhysBiol. Sci. 85, 348-362 (2009).
- Nakagawa, M., et al. A novel efficient feeder-free culture system for the derivation of human induced pluripotent stem cells. Sci. Rep. 4, 3594 (2014).
- Hockemeyer, D., Jaenisch, R. Induced Pluripotent Stem Cells Meet Genome Editing. Cell stem cell. 18, 573-586 (2016).
- Komor, A. C., Badran, A. H., Liu, D. R. CRISPR-Based Technologies for the Manipulation of Eukaryotic Genomes. Cell. 169, 559 (2017).
- Komor, A. C., Badran, A. H., Liu, D. R. CRISPR-Based Technologies for the Manipulation of Eukaryotic Genomes. Cell. 168, 20-36 (2017).
- Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nat. Biotech. 32, 347-355 (2014).
- McElroy, S. L., Reijo Pera, R. A. Preparation of mouse embryonic fibroblast feeder cells for human embryonic stem cell culture. CSH Protoc. 2008, (2008).
- Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, E1848-E1857 (2012).
- Rezania, A., et al. Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells. Nat. Biotech. 32, 1121-1133 (2014).
- Shi, Y., Inoue, H., Wu, J. C., Yamanaka, S. Induced pluripotent stem cell technology: a decade of progress. Nat. Rev. Drug Discov. 16, 115-130 (2017).
- Wang, B., et al. Highly efficient CRISPR/HDR-mediated knock-in for mouse embryonic stem cells and zygotes. BioTechniques. 59, (2015).
- Liang, X., Potter, J., Kumar, S., Ravinder, N., Chesnut, J. D. Enhanced CRISPR/Cas9-mediated precise genome editing by improved design and delivery of gRNA, Cas9 nuclease, and donor DNA. J Biotech. 241, 136-146 (2017).
