Summary
וזמינותו של כרומטין נגיש Transposase בשילוב עם תפוקה גבוהה רצף (האטא ק-seq) היא שיטה הגנום כולו לחשוף כרומטין נגיש. זהו פרוטוקול האטא ק-seq צעד אחר צעד, ממולקולרית לניתוח הסופי חישובית, אופטימיזציה עבור האדם לימפוציטים (Th1/Th2). פרוטוקול זה יכול להיות מאומץ על ידי חוקרים ללא ניסיון קודם בשיטות הדור הבא רצפי.
Abstract
וזמינותו של כרומטין Transposase נגיש עם תפוקה גבוהה רצף (האטא ק-seq) היא שיטה לצורך זיהוי פתוח מחוזות כרומטין (נגיש). אזורים אלה מייצגים רגולטוריות DNA אלמנטים (למשל, היזמים, מוצרי טיפוח טבעיים, לוקוס שליטה אזורים, insulators) שעתוק אילו גורמים איגוד. מיפוי הנוף כרומטין נגיש היא גישה רב-עוצמה לרכיבים שיגורי רגולציה פעילה ברחבי הגנום. מידע זה משמש גישה לא משוחדת על גילוי הרשת של גורמי שעתוק הרלוונטיים ומנגנונים של הכרומטין המפקחים על תוכניות ביטוי גנים. האטא ק-seq היא חלופה חזקה ורגיש DNase אני ניתוח רגישות יתר בשילוב עם הדור הבא רצפי (DNase-seq) ובידוד פורמלדהיד בסיוע של אלמנטים רגולטוריות (שלהם-seq) לניתוח ברמת הגנום של כרומטין נגישות וכדי הרצף של נוקלאז רגיש micrococcal אתרים (MNase-seq) כדי לקבוע את מיקום נוקלאוזום. אנו מציגים פרוטוקול האטא ק-seq מפורט ממוטב עבור החיסון האנושית ראשי תאי CD4 + כלומר לימפוציטים (T helper 1 (Th1) ותאים Th2). פרוטוקול מקיף זה מתחיל עם תא הקציר, מתאר את ההליך מולקולרית של כרומטין tagmentation, הכנת הדוגמא עבור הדור הבא רצפי, ואז כולל גם שיקולים הבדיקות חישובית נהגה ושיטות לפרש את התוצאות. יתר על כן, כדי לחסוך זמן וכסף, הצגנו את אמצעי בקרה כדי להעריך את ספריית האטא ק-seq לפני רצף. חשוב, העקרונות שהוצגו פרוטוקול זה מאפשר שלה ההסתגלות אחרים תאים ראשי אנושיים של המערכת החיסונית, הלא-החיסון, שורות תאים. קווים מנחים אלה גם יהיה שימושי עבור מעבדות אשר אינם בקיאים בשיטות הדור הבא רצפי.
Introduction
האטא ק-seq1,2 היא שיטה חזקה המאפשרת זיהוי של אזורים פתוחים כרומטין רגולטוריות3 והמיקום נוקלאוזום. מידע זה מוחל על אומדן משוער, זהות, והמיקום פעילותם של גורמי שעתוק. רגישות השיטה למדידת כמותיים בווריאציות הכרומטין מאפשר חקר הפעילות של כרומטין גורמים, כולל כרומטין remodelers מגבילים, כמו גם את הפעילות תעתיק של RNA פולימראז II1. ובכך האטא ק-seq מספק גישה רציונלית ובלתי עוצמה בפענוח מנגנוני המפקחים על תעתיק רגולציה בכל סוג התא של ריבית. אנו מתארים את העיבוד של האטא ק-seq תאי Th1 ו Th2 אדם ראשי.
ב האטא ק-seq, transposase Tn5 היפראקטיבי עמוסה מתאמים עבור הדור הבא רצפי (הגדרות) זוגות DNA פיצול עם תיוג של ה-DNA עם מתאמים (כלומר, תהליך "tagmentation")1. בעקבות ה-PCR-הגברה, ספריות DNA שנוצר מוכנים עבור הדור הבא רצפי (איור 1). Tagmentation מועדף של כרומטין נגיש הוא זוהה על ידי הניתוח של העשרה המקומיים הקריאות רצף האטא ק-seq.
ניתוח ניסיוני קצר ואת הדרישה פחות חומר המוצא, ביחס שיטות אחרות למדידת כרומטין נגישות ומיקום nucleosomal כגון DNase-seq4, שלהם-seq5MNase-seq6, יש קידם את השימוש האטא ק-seq במערכות ביולוגיות מרובות, כולל תאים אנושיים ראשי1,7 דוגמאות קליניות8, וכן אורגניזמים חד־תאיות9, צמחים10, זבובי פירות11 , יונקים שונים12.
זהותו של שעתוק ניתן חשפו גורמים שמאוגדים לוקוסים נגיש על ידי ניתוח את העשרת של מוטיבים רצף שלהם מחייב או שילוב האטא ק-seq עם כרומטין immunoprecipitation (ChIP) ואחריו (רצפי DNA תפוקה גבוהה ChIP-seq). גישה זו איפשרה זיהוי גורמי שעתוק ספציפיים שושלת היוחסין חשוב hematopoiesis העכבר13. הטבע לא משוחד ואשר הכללית של האטא ק-seq מאפשר ללמוד הכונה אורגניזמים אשר ריאגנטים כגון נוגדנים לניתוח שבב אינם זמינים. לדוגמה, אבולוציונית וריאציות ב- cis-אזורים רגולטוריות זוהו על ידי לימוד הרכס העצבי הגולגולת תאים מן השימפנזים ובני14, וריאציות התפתחותית ברכיבי תקינה במהלך העכבר בתחילת מופרה15, שינויים בנוף תקינה במהלך מחזור החיים של חד־תאיות owzarzaki ג9, והתפתחות של היזמים, משפרי מעבר יונקים 20 מינים12.
האטא ק-seq היה גם אינסטרומנטלי למדידת כרומטין נגישות בתאים בודדים, ובכך לחשוף השתנות בתוך אוכלוסיות תאים, אשר בדרך כלל מתחמק מחקרים ברמת הגנום7,16. בנוסף, ניתן להשתמש האטא ק-seq ללמוד שינויים המתרחשים באזורים רגולטוריות DNA בתנאים מחלה, שבה מדגמים נדירים. לדוגמה, ניתן להשתמש האטא ק-seq ללמוד שינויים בנוף תקינה במהלך תחילת לוקמיה מיאלואידית חריפה (AML)17 או ראס-מונע oncogenesis11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל ההליכים אושרו על-ידי הועד המוסדי של אוניברסיטת בר אילן, הפרוטוקול מנחים שסופקו על-ידי הוועדה לאישור הניסויים.
1. טיהור של תמים CD4 + תאים אנושיים, קיטוב T Helper 1 (Th1) ותאים Th2
הערה: כאן אנו מתארים את ההליך מתחיל מתאי תאי דם היקפיים האנושי קפוא (PBMCs). הצעד הראשון מורכב בידוד תאי CD4 + באמצעות גרגרי, עמודות שבדרך כלל לתת לנו יותר מ 95% תאי CD4 +. עם זאת, שלב זה עשוי להשתנות לפי הפרוטוקול המועדף במעבדה כל. הפרוטוקול עבור הפעלת תא T, קיטוב שונה מן ג'נר. et al. (2009) 18. תאי בידוד של CD4 + מ- 10 מיליון PBMCs נותן לעלות 4-6 מיליון תאי CD4 +. הם לפצל שתי מבחנות, גדל תחת Th1 ו Th2 מקטב תנאים מניב תאי Th1 ו Th2 3-5 מיליון בתוך שבוע.
הערה: להתקרר לצנטריפוגה עד 4 ° C לפני שמתחילים.
- להפשיר 1 מ ל PBMCs האנושית (10 7 תאים) צינור 50 מ ל המכיל 10 מ"ל של מדיום RPMI בתוספת 1% פניצילין-סטרפטומיצין, 2 מ מגלוטמין ו- 10% לא פעיל חום העובר שור סרום. צנטריפוגה ב 500 g x עבור 5 דק. הסר תגובת שיקוע, resuspend התאים עם פיפטה סטרילי 25 מ ב-15 מיליליטר שהושלם RPMI בינונית. להעביר את התאים (עם פיפטה סטרילי 25 מ ל) בקבוקון תרבות T75-
- להשאיר למשך הלילה בתאים חממה humidified (37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2).
- להעביר את התאים צפים עם פיפטה סטרילי 25 מ ל שפופרת 50 מ. לקבוע את המספר ואת הכדאיות מאת הדרה trypan blue.
- תאים לבודד CD4 + 10 מיליון חיים שאינם-מחסידי PBMCs לפי בחירה חיובי באמצעות CD4 + גרגרי ועמודות על פי היצרן ' s המלצות (ראה טבלה של חומרים/ציוד) עם הבאה שינויים: 10 7 PBMCs מסומנות עם 30 µL של גרגרי CD4 ב 120 µL של 0.5% BSA ב- PBS.
- להפעיל את התאים CD4 + T עבור 72 h על-ידי rhIL-2 (10 ng/mL), צלחת מכורך אנטי CD3 (5 µg/mL) ו- anti-CD28 מסיסים (2 µg/mL). קיטוב Th1, הוסיפו rhIL-12 (20 ng/mL), אנטי-IL-4 (10 µg/mL). קיטוב Th2, להוסיף rhIL-4 (40 ng/mL) ו- anti-IFN-γ (10 µg/mL).
- התרבות התאים נוספים 7 ימים בנוכחות rhIL-2 (10 ng/mL), ציטוקינים מהפכנית אותו (rhIL-12 ל- Th1 ו- rhIL-4 עבור Th2).
2. בידוד גרעינים
הערה: האטא ק-seq מבוצע עם גרעינים שלמים. פירוק מאגר המכילה 0.05% nonylphenyl פוליאתילן גליקול (ראה טבלה של חומרים/ציוד) היה מכויל לבידוד גרעינים של ראשי האנושי תאי Th1 ו- Th2. מומלץ לכייל את שלב זה עם ריאגנטים המעבדה, תאים. עודף של תאים שלמים דטרגנט לא מספיקות מקטין את יעילות התגובה טרנספוזיציה. יעילות פירוק התא נקבע לפי מספר גרעינים (תאים חיוביים trypan blue) ביחס למספר התאים.
הערה: הכנת המאגר פירוק (10 מ מ טריס-HCl, pH 7.5, 10 מ מ NaCl, 3 מ מ MgCl 2). להתקרר צנטריפוגה עם רוטור סווינג-דלי ל- 4 מעלות צלזיוס Pelleting התאים צנטריפוגה סווינג-דלי במקום צנטריפוגה זווית קבועה מפחית אובדן התא/גרעינים. כדי להימנע גרעינים או איבוד תאים, pipet בזהירות בעת השלכת את תגובת שיקוע.
- הוסף nonylphenyl טריים פוליאתילן גליקול (כדי ריכוז סופי של 0.05%) ו- 100 x מעכבי פרוטאז (כדי ריכוז סופי של 1 x) אל המאגר הקר פירוק מיד לפני השימוש. לשמור על המאגר על קרח
- תאי Count T כדי לקבוע את הסכום שלהם ואת הכדאיות בשיטת trypan blue. הכדאיות נמוכים יותר 90% תוצאות לעיכול שאינם ספציפיים גבוה יותר.
- העברת 0.5 x 10 6 T תאים (Th1 או Th2) 1.5 mL microtubes. ספין למטה ב 500 g x עבור 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס
- Resuspend בגדר תא ב- 1 מ ל תמיסת מלח קרות באגירה פוספט (PBS). ספין למטה ב 500 g x עבור 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס
- Resuspend בגדר תא ב 1 מ"ל של מאגר פירוק קר (המכילה nonylphenyl פוליאתילן גליקול, מעכבי פרוטאז). שמור את הצינורית על קרח. פיפטה בעדינות כדי להימנע מהפרעה הגרעינים.
- לקחת את 10 µL ובמהירות לספור את התאים עם מונה הניתן תא אוטומטית אמנם microtube עם תאים lysed על הקרח. שלב זה לא יעלה על 5 דקות כדי למנוע נזק הגרעינים. לפחות 80% של התאים צריך להיות lysed.
- המשך מיד עם התגובה טרנספוזיציה. גרעינים מוכנים להמשיך קרח
3. טרנספוזיציה התגובה
הערה: בשלב זה, גרעינים בודדים מודגרת עם prokaryotic transposase Tn5 (TDE1) נטען עם מתאמי עבור רצף המיתרים. Tn5 אקטיבי בו זמנית קטעים דנ א, ligates מתאמי למחוזות נגיש של הגנום (תהליך tagmentation). היחס בין הגרעינים Tn5 transposase הוא קריטי עבור ביקוע חלבונים מועדף-כרומטין נגיש. פרוטוקול זה מכויל עבור גרעינים 100,000 באמצעי אחסון התגובה μL 100. עם זאת, ניתן לשנות את התגובה.
- להגדיר טמפרטורה ב שייקר תרמית כדי 37 מעלות צלזיוס.
- 100,000 העברת גרעין כדי microtube 1.5 מ ל.
- צנטריפוגה ב 500 x g למשך 10 דקות ב 4 ° C ובעדינות להסיר את תגובת שיקוע.
- להוסיף את רכיבי התגובה טרנספוזיציה הגרעינים כמו שצוין ב טבלה 1-
- Resuspend על ידי עדינה pipetting.
- דגירה התגובה טרנספוזיציה ב שייקר תרמי ב 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות עם עדין רועדות (500 סל ד).
הערה: ה-DNA ניקוי מתבצע על ידי מחרוזת הנייח הפיך מוצק-שלב 19 (ראה טבלה של חומרים/ציוד) או עמודות טיהור PCR. בסוף הניקוי, elute שברי DNA ב 20 µL 10 מ מ טריס-HCl, pH 8. להימנע EDTA במאגר • תנאי.
4. PCR העשרה של ספריות האטא ק-seq
הערה: שלב זה נועד להגביר את האטא ק-seq ספריית קרי, דנ א שברי עם מתאמי שנוספו. כדי לאפשר ערבוב של מספר ספריות האטא ק-seq באותו הדור הבא רצפי הנתיב (" ריבוב ") שימוש מדד פריימר 1 (Ad1_noMx) 1 עבור כל הדגימות, ובעלות שונה אינדקס (לבר-קוד) 2 פריימר (Ad 2.1-2.24) 1 עבור כל דגימה. רצפי פריימר ניתנים שהושלם טבלה של חומרים/ציוד.
- הגברה PCR הראשונית
הערה: הריכוז בעבודה של פריימר 1 (Ad1_noMx) ו- 2 פריימר הוא 25 מיקרומטר. כל תחל מדולל מן המניות המקוריים של מיקרומטר 100 מיקרומטר 25. בכל התגובות PCR, השתמש פריימר 1 (Ad1_noMx), רק אחד של 2 פריימר באינדקס.- להוסיף את רכיבי התגובה PCR כמפורט בטבלה 2 צינור PCR סטרילי.
- המקום PCR צינור לתוך הצנטרפוגה תרמי ולבצע PCR הגברה באמצעות התנאים אופניים מפורט בטבלה 3.
- הערכה של מספר מחזורי הגברה נוספת
הערה: מספר מחזורי PCR נוספים אמור להניב כמות מספקת של ספריית מקטעי f. או מוצלח הדור הבא רצפי לרוץ, כל עוד ממוזער כדי להימנע GC, גודל הסטייה 20... קביעת המספר של ה-PCR מחזורים (N) הדרושים עבור ספריית אופטימלית פרגמנט הגברה נעשית על ידי ה-PCR כמותי (qPCR).- לדלל צבעי יסוד 1 (Ad1_noMx) ו-2 (משמש עבור ספריית הראשונית הגברה) מ מיקרומטר 25 מיקרומטר 6.25.
- להוסיף את רכיבי המבחנות אופטי או צלחת כאמור בטבלה 4.
- המקום כלי qPCR, מחזור כמו כמפורט בטבלה 5.
- כדי להעריך את המספר הנדרש של מחזורים נוספים הגברה (N), מגרש מחזור מספר על ציר ה-x ואת יחסי קרינה פלואורסצנטית (RFU) בציר ה-y.
- המספר של הגברה נוספת מחזורים (N) הוא 1/3 של מספר מחזורים שבהם התגובה qPCR להגיע אל הרמה. איור 2 מספק דוגמאות עבור שלוש ספריות האטא ק-seq שהגיעו plateau ב ~ 2,350 פלורסצנטיות היחסי של יחידות, RFU (בעובי הקו הירוק). מספר מחזורים PCR שבו מוגבר שליש מהסכום המקסימלי (783 RFU, המסומן על ציר ה-y) מקביל 8 מחזורים של הספריות (אדום וכחול הגברה עקומות) שני ומחזורי PCR 9 עבור הספריה השלישי (ורוד)-
- הגברה PCR הסופי
- להגביר את µL 45 הנותרים של תגובת ה-PCR. הצב צינור PCR המכיל הגברה תגובה של צעד 4.1.2 הצנטרפוגה תרמי. הפעל את התוכנית PCR שמתואר טבלה 6. השתמש במספר שנקבע בעבר (שלב 4.2.5) מחזורים הגברה (N).
5. גודל הבחירה של ספריות האטא ק-Seq
הערה: מניסיוננו, בחירת גודל של ספריות האטא ק-seq מוגבר משפר תוצאות הדור הבא רצפי מכיוון שהוא מבטל את שברי ספריית משקל מולקולרי גבוה ספריית האטא ק-seq הסופי.
הערה: לאפשר את החרוזים מגנטי לחמם לטמפרטורת החדר 30 דקות לפני השימוש.
להכין טרי אתנול 70% במים נטולי נוקלאז.
- Resuspend את החרוזים מגנטי על ידי ערבוב.
- להוסיף מים נטולי נוקלאז לספריות האטא ק-seq (מתקבל בשלב 4.3.1.) ולהביא עד 100 µL.
- µL להוסיף 50 (0.5 x) של resuspended DNA-איגוד beads מגנטי כדי 100 µL של ספריות מוגבר. מערבבים על-ידי pipetting למעלה ולמטה לפחות 10 פעמים. דגירה בדגימות למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. במידת הצורך, במהירות ספין למטה microtubes.
- במקום הצינור על דוכן העדים מגנטי המתאים למשך 2 דקות להפריד את החרוזים מגנטי תגובת שיקוע. לאחר 2 דקות, להעביר את תגובת שיקוע microtube חדש-
- למדוד הנפח של תגובת שיקוע על ידי pipetting ולהוסיף 0.7 x של beads מגנטי. מיקס על ידי pipetting למעלה ולמטה לפחות 10 פעמים.
- דגירה 5 דקות בטמפרטורת החדר. המקום על דוכן מגנטי עבור 2 דק
- לאחר 2 דקות דגירה, למחוק את תגובת שיקוע. להוסיף 200 אתנול 70% µL טריות לשטוף את החרוזים אמנם הצינורות על הדוכן מגנטי.
- לשמור microtube על המגנט ב-30 s וביטול ואז האתנול. חזור על שלב 5.7.for מנקי אתנול הסופי שני.
- להסיר לחלוטין את הנותרים אתנול ולתת שהחרוזים מילה נהדרת עבור 5 דקות ברכבת התחתית נמצאת על המגנט. במידת הצורך, בקצרה לסובב את microtube. להסיר את עקבות אתנול עם טיפ פיפטה p10.
- להסיר את microtube של המגנט ולהוסיף µL 22 10 מ מ טריס-HCl, pH 8. לא elute את ספריות האטא ק-seq במאגר המכילה EDTA.
- דגירה הצינור למשך 2 דקות בטמפרטורת החדר ולאחר מכן מקם לדוכן מגנטי.
- כאשר הפתרון ברור, להעביר 20 µL של ספריות eluted microtube עקר חדש.
- חנות בגודל שנבחר האטא ק-seq ספריות ב-20 מעלות צלזיוס
6. ניתוח איכותי של ספריות האטא ק-Seq
- אימות של איכות האטא ק-seq ספריות באמצעות PCR בזמן אמת
הערה: חשוב להעריך את האות לרעש יחס של ספריות האטא ק-seq לפני הדור הבא . רצף. פעולה זו מתבצעת על-ידי קביעת הכמות היחסית של שברי DNA לוקוסים נגיש בלתי נגיש באמצעות PCR כמותי (qPCR). רוח המקום לא נגיש (שליטה שלילי, chr1:48, 137, 860-48,137,934 ו- chr1:193, 093, 748-193,093,827) הם מוגבר על ידי זוגות פריימר 1 ו- 2. רוח המקום נגיש (שליטה חיובית, chr19:30, 336, 166-30,336,253 ו- chr19:11546154-11546237) הם מוגבר על ידי זוגות פריימר 3 ו- 4. לוקוסים חיוביים ושליליים הוגדרו מפרופילים נגישות (DHS-seq) כרומטין CD4 + תאים אנושיים (קידוד accessions ENCSR000EQE ו- ENCSR000EQG). פריימר שלילי 1 ממוקם אזור intergenic heterochromatic גדולים (kb 230 מ TRADB2, 88 kb של FOXD2). אזור בקרה שלילית 2 נמצא בתוך אינטרון הראשון של ג'ין CDC73. חיובי פריימר זוג 3 נמצא אזור פתוח כרומטין במורד הזרם של הגן Cyclin E (CCNE1) תוך פריימר חיובי זוג 4 ממורכזת בתוך האמרגן של חלבון קינאז C המצע 80K-H (PRKCSH). חשוב, לוקוסים שליטה אלה מראים דפוס דומה של נגישות בסוגי תאים אנושיים פרוייקט ' קידוד ' 3, רומז כי ניתן להחילם לפקח האטא ק-seq ספריות של קשת רחבה של סוגי תאים אנושיים. פריימר יעילות וספציפיות של כל זוגות פריימר אומתה על ידי qPCR לדילול טורי של דנ א גנומי (מתוך תאי Th אדם) וניתוח עקומת ההיתוך של מוצרים מוגבר שהושג.- לבודד דנ א גנומי באמצעות זמינים מסחרית קיט (ראה טבלה של חומרים/ציוד).
- לדלל את האטא ק-seq מוגבר הספרייה 1:10 (ספריית µL 1 + 9 µL של מים נטולי נוקלאז) ו- DNA גנומי ל ~ 5 ng/µL.
- להכין תערובת התגובה (טבלה מס ' 7) עבור כל זוג פריימר בקרה חיובית ושלילית, לקחת בחשבון התגובות מבוצעות שהפקידים.
- Incubate ב qPCR הצנטרפוגה תרמי לפי הפרוטוקול המומלץ על ידי הספק מיקס מאסטר qPCR.
- לנתח את התוצאות ב- qPCR כלי ' s תוכנה (ראה טבלה של חומרים/ציוד). בחרו ' DNA גנומי דגימת הבקרה. הערכים שהושג מייצגים של העשרה של אזורים נגיש (מוגבר על ידי בקרה חיובית תחל). לדוגמה מוצג בטבלה 8.
הערה: הערכה של גודל הספרייה הממוצע, ריכוז: התפלגות גודל שברי DNA האטא ק-seq מספריות של נקבעת על-ידי מערכות אלקטרופורזה אוטומטיות רגישות גבוהה על פי היצרן ' s הוראות. מומלץ למדוד את הדגימה התרכזות fluorometer באמצעות ערכת רגישות גבוהה dsDNA ו- µL לפחות 2 של כל דגימה של הדנ א.
הערה: הדור הבא רצפי - לפני ריבוב של הספריות, לחשב את molarity של כל ספריה האטא ק-seq באמצעות הנוסחה: (ng/µL x 10 6) / (660 x ממוצע ספריית קטע אורך). . כווני > 30 מיליון קריאות של כל ספריה האטא ק-seq להעריך כרומטין פתוח אזורים של דגימות אנושי. אם ברצונך לקבוע אם הספרייה הוא מספיק טוב בשביל המיתרים רצף, בתחילה המטרה עבור קריאות ~ 10 מיליון (5% הסמטה רצפי DNA רצף כלי במצב ריצה מהירה). זכור כי להסיק נוקלאוזום מיצוב, לזווג-קצה הרצף הוא נדרש 1-
7. ניתוח של התוצאות שהושגו רצף הדור הבא
- יסיק האיכות של פעולות רצף הקריאה על-ידי בדיקה הקבצים FastQC, בנפרד עבור כל ספריית.
- יישר את הקריאות על הגנום האנושי הפניה (hg19 הרכבה) באמצעות עניבת הפרפר 21 תוכנה בסביבת Unix/Linux. הפקודה היא ' עניבת הפרפר -m 1 - q -S הגנום מדריך reads.fastq output_aligned.sam '. מדריך הגנום מייצג את התיקיה שבה מאוחסנות האינדקסים הגנום של עניבת הפרפר. פרמטר -m 1 היא עבור אינו מאפשר יישור הקריאות אל אחד או יותר לוקוס הגנום - q עבור קובץ הקלט צריך להיות בתבנית fastq, -S הוא לפלט בתבנית סאם.
- להסיר כפילויות קריאות באמצעות SAMtools 22 rmdup אפשרות בסביבת Unix/Linux. הפקודות הן ' samtools להציג output_aligned.sam -S -b | samtools למיין -o-output_aligned > output_aligned.bam ',
samtools rmdup -s output_aligned.bam output_aligned _rmdup.bam '. הפקודה הראשונה, תצוגה, שינוי התבנית סאם בפורמט באם אשר לאחר מכן ממוינים. האפשרות של rmdup ואז חלה על הקובץ באם הממוין. באופן אופציונלי אחד ניתן להתאים את הקריאות עבור האתר הכניסה transposon, כפי שמתואר את הנייר המקורי האטא ק-seq 1. פעולה זו מתבצעת באמצעות BEDtools מצווה 23 בסביבת Unix/Linux. הפקודות הן ' bamToBed -i output_aligned _rmdup.bam > output_aligned _rmdup.bed ', ' shiftBed -i הגנום 4 - מ-5 - g -p _rmdup.bed output_aligned > output_aligned _rmdup_adjusted.bed '. הפקודה הראשונה, bamTobed, שינוי התבנית באם בפורמט מיטה אשר יכול לשמש עבור הפקודה shiftBed. הקובץ הגנום הוא קובץ מופרד כרטיסיה המכילה את האורך של כל כרומוזום הגנום. בדרך כלל להוסיף את הקובץ בספריה BEDtools.
שיא - לבצע חיוג באמצעות ניתוח המבוסס על מודל של שבב-seq (MACS2) 24 תוכנה בסביבת Unix/Linux על הקובץ מיטה שהוסטו עם הפרמטרים הבאים: - nomodel - extsize 75--משמרת-30. פרמטרים אלה משמשים כדי להתאים את הקריאות כך האתר ההכנסה transposon הוא באמצע כל קריאה רצף.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
התוצאה הסופית של פרוטוקול זה הוא ספריה האטא ק-seq של בדרך כלל 3-20 ng/µL. מתי לרוץ על מערכת עבור ניתוח שלמות הדנ א (ראה טבלה של חומרים/ציוד), הם מציגים מראה כמו סולם2 (איור 3 א). הגודל הממוצע של קטעי DNA היא בדרך כלל bp ~ 450-530.
בקרת איכות נאותה של ספריות האטא ק-seq לפני שתבצע הדור הבא רצפי חשוב לחסוך זמן וכסף. אנו רואים את הספריות מתאים הדור הבא רצפי (הגדרות) כאשר העשרת של פקדים חיובית יותר מ 25 - ו 75 פי (עבור פריימר זוגות 3 ו-4, בהתאמה) ביחס שלילי פקדים (איור 3B) וכאשר הם מראים המראה nucleosomal, כמו סולם שהוזכרו קודם לכן. בעת ניתוח הנתונים qPCR, אנחנו נמצאים גם אימות כי הערכים סי עבור פקד ואתאיזם תחל דומים בתגובות עם דנ א גנומי כתבנית ו כי סי הערכים עבור אזורים שליטה שלילי (בתגובות עם האטא ק-seq הדנ א שברי) הם קבועים בין הניסויים. לדוגמה, במקרה של ערכים נמוכים יותר פתאום סי, אנחנו חושדים כי הגרעינים היו משורבב יתר על המידה, לכן שברי DNA שמקורם מאזורים הטרוכרומטין הם מייצגים יתר על המידה. יתר על כן, אם התמונה ג'ל (מתקבל על ידי אלקטרופורזה סרט המבוסס על רגישות גבוהה) של ספריות האטא ק-seq מצביעה על נוכחות מתאמים (~ 120 bp), השפלה DNA מוגזמת (רוב השברים הם ~ 200 bp), או קטעים גדולים (מעל 1 kb), אנחנו לא תמשיך לשלב המיתרים.
יתר על כן, אנו תמיד לבצע הגדרות הראשוני שבו אנו שואפים עבור 10 מיליון קורא לכל ספריית. אם התוצאות של רצף זה משביעות (לדוגמה עובר כל הפרמטרים קובץ הדו ח FastQC, אפשר להשיג 1000-2000 פסגות לאחר ביצוע חיוג שיא), הספריות הן וסודרו עמוק יותר (ספריית reads/האטא ק-seq ליותר מ-30 מיליון).
ב האטא ק-seq ניסויים בתרבית של תאים, בכל מקום מ ~ 30-70% הקריאות ברצף יכול לנבוע mtDNA10. לעומת זאת, ספריות שלנו הכיל 6-20% קריאות למפות את הגנום מיטוכונדריאלי. . זה נמוך יותר דווח על 46% בספריה האטא ק-seq האנושי CD4 + T לימפוציטים1. לאחר ביטול אלה מזהמות קריאות, נשארנו עם ~ 7-32 מיליון קריאות ייחודי מיפוי הגנום האנושי הפניה (58% - 91% של כל קורא). אלה, 0.1 - 2 מיליון קריאות (6.8% - 12% הקריאות כל) היו האטא ק-seq פיקס (איור 4).
איור 1 . זרימת עבודה של צעדים ניסיוני. ייצוג של הרב-סרן נכנס לפרוטוקול זה האטא ק-seq. נקודות עוצרים מסומנים באמצעות משושים צהוב. שלב אופציונלי מיוצג עם משושה תפוז. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 . חישוב של מספר מחזורים PCR הדרושות את העשרת הסופי של ספריות האטא ק-seq נוספים- PCR עקומות הגברה עבור שלוש ספריות seq ATAC שונים מוצגים אדום, כחול וורוד. התגובות הגברה להגיע אל מישור-2,350 RFU (קו אופקי ירוק העליון). מספר מחזורים נוספים PCR חותך עם RFU 783 (2,350/3) על העקומה הגברה. שתי ספריות (אדום וכחול) דורשות 8 מחזורים הגברה נוספת בעוד הספרייה השלישית (ורוד) דורש 9 מחזורים. תבנית ללא שליטה (NTC) מוצג הקו הירוק התחתון. ציר x, מספר המחזור. ציר ה-y, RFU יחידות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3 . בקרת איכות ניתוח של ספריות האטא ק-seq. (א) תוצאות אלקטרופורזה אוטומטיות מבוססי קלטת של ספריות האטא ק-seq מוגבר. L, סולם; A-D, ספריות של הביולוגיה חוזר של תאי Th1 ו- Th2. (B) ניתוח בקרת איכות qPCR של ספריות האטא ק-seq. דנ א גנומי וספריות האטא ק-seq ארבעה היו מוגבר על ידי זוגות פריימר שליטה שלילי (1 ו 2) תחל בקרה חיובית (3 ו- 4). הערכים שהושג עבור ספריות האטא ק-seq (כחול) היו מנורמל קודם את רמות הגברה של דנ א גנומי (מוגדר באופן שרירותי הערך 1; אדום). לאחר מכן, הערכים עבור אזורים בקרה חיובית היו מנורמל לאזורי שליטה שלילי (תרשים נמוכה יותר). ספריות #1 ו #2 נשלחו רצף המיתרים. הערכים מייצגים זאת אומרת ± ב- SEM אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4 . הגנום דפדפן snapsh פאלו ורדה נגיש כרומטין אזורים בתוך תאי Th1 ו- Th2. רצועות האטא ק-seq מוצגים עבור NFKB1, יוני, CD28, IFNG (מבוטא רק ב Th1), IL4 ו IL13 (מבוטא רק ב- Th2) לוקוסים תאי Th1 ו Th2 (ביולוגית שני חוזר על עצמו עבור כל אחד). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
| מאגר TD | 50 | ΜL |
| TDE1 transposase | 5 | ΜL |
| נוקלאז ללא מים | 45 | ΜL |
| הנפח הכולל | 100 | ΜL |
טבלה 1: הכנת תערובת התגובה טרנספוזיציה.
| ספריית seq האטא ק | 15 | ΜL |
| פריימר 1 (Ad1_noMx) * | 2.5 | ΜL |
טבלה 2: מרכיבי תערובת התגובה הראשונית PCR (שלב 5.1.1.).
| שלב מחזור | טמפרטורה | זמן | מחזורים |
| סיומת * | 72 ° C | 5 דקות | 1 |
| דנטורציה הראשונית | 98 ° C | 30 s | |
| דנטורציה | 98 ° C | 10 s | 5 |
| חישול | 63 ° C | 30 s | |
| סיומת | 72 ° C | 3 דקות | |
| . תחזיק | 4 ° C | ∞ | |
| * השלב נדרשת כדי להרחיב את שניהם | |||
| קצוות תחל לאחר התגובה טרנספוזיציה. | |||
טבלה 3: PCR תנאי הרכיבה עבור ספריית הראשונית הגברה (שלב 5.1.2.)
| Aliquot של תגובת ה-PCR (שלב 4.1.1) * | 5 | ΜL |
| פריימר 1 (Ad1_noMx) * * | 1 | ΜL |
| פריימר 2 | 1 | ΜL |
| מיקס מאסטר x SYBR 2 * * * | 7.5 | ΜL |
| נוקלאז ללא מים | 0.5 | ΜL |
| הנפח הכולל | 15 | ΜL |
| * עבור פקד שאינם מתבנית במקום תבנית ה-DNA להוסיף מים אולטרא טהורים. | ||
| * * הריכוז הסופי של כל פריימר הוא 417 ננומטר. | ||
| השתמש מיקס מאסטר המועדפת עבור qPCR. | ||
| הוא צריך להכיל פולימראז, dNTPs, MgCl2ו הפלורסנט. | ||
טבלה 4: הכנת תערובת התגובה qPCR (שלב 5.2.2).
| שלב מחזור | טמפרטורה | זמן | מחזורים |
| דנטורציה הראשונית | 98 ° C | 30 s | 1 |
| דנטורציה | 98 ° C | 10 s | 20 |
| חישול | 63 ° C | 30 s | |
| סיומת | 72 ° C | 3 דקות | |
| . תחזיק | 4 ° C | ∞ |
טבלה 5: רכיבה על אופניים-תנאים מבוססי qPCR assesment נוספים מספר מחזורים הגברה (N) (שלב 5.2.3.)
| שלב מחזור | טמפרטורה | זמן | מחזורים |
| דנטורציה הראשונית | 98 ° C | 30 s | 1 |
| דנטורציה | 98 ° C | 10 s | N |
| חישול | 63 ° C | 30 s | |
| סיומת | 72 ° C | 3 דקות | |
| . תחזיק | 4 ° C | ∞ |
טבלה 6: רכיבה על אופניים התנאים עבור השלב העשרה PCR הסופי (שלב 5.3.).
| לתגובה PCR יחיד: | ||
| דילול של הספרייה של דנ א גנומי | 2.5 | ΜL |
| ΜM 10 תחל F (F1 או F2 או F3 F4) * | 0.3 | ΜL |
| ΜM 10 תחל R (R1 או R2 או R3 או R4) * * | 0.3 | ΜL |
| מיקס מאסטר x SYBR 2 * * * | 5 | ΜL |
| נוקלאז ללא מים | 1.9 | ΜL |
| הנפח הכולל | 10 | ΜL |
| * הריכוז הסופי של כל תחל בתערובת התגובה הוא 300 ננומטר. | ||
| * * אם באמצעות פריימר F1 ממה ומהצמיגים R צריך להיות R1 ועוד. | ||
| שימוש העדיף 2 x מיקס מאסטר מתאים המכשיר qPCR במעבדה שלך. | ||
טבלה 7: תנאי ריאקציה לניתוח QC (שלב 7.1.3.).
| היעד | מדגם | זאת אומרת סי | סי SEM | הכמות היחסית | מנורמל | |
| 1 | בקרה שלילית | Seq האטא ק | 30.39 | 0.11 | 1 | 1.01 |
| gDNA | 30.4 | 0.16 | 0.99 | 1 | ||
| 2 | Seq האטא ק | 30.3 | 0.18 | 1 | 1 | |
| gDNA | 30.34 | 0.09 | 0.99 | 1 | ||
| 3 | בקרה חיובית | Seq האטא ק | 23.27 | 0.03 | 1 | 173.14 |
| gDNA | 30.7 | 0.06 | 0.01 | 1 | ||
| 4 | Seq האטא ק | 21.55 | 0.24 | 1 | 750.31 | |
טבלה 8: חישוב העשרת של פקדים חיובי מעל לפקדים שלילי (שלב 7.1.5.).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פרוטוקול האטא ק-seq המתוארים כאן כבר בהצלחה מועסקים לניתוח של כרומטין נגיש בתאים הראשי (Th1 אנושי, Th2 תאים, ותאי B) כמו גם שורות תאים בתרבית (תאי סרטן השד אנושי MCF10A ו- U261 גליובלסטומה תאים). החלת האטא ק-seq סוגי תאים אחרים עשויים לדרוש קצת אופטימיזציה פרוטוקול, במיוחד בשלב פירוק. אם הריכוז של דטרגנט ללא יונית גבוהה מדי, אולי יש אחוז גבוה יותר של זיהום דנ א מיטוכונדריאלי. זה יכול להיות מופחת על ידי הפחתת ריכוז דטרגנט במאגר של פירוק מבלי להפחית את התשואה גרעינים. מניסיוננו, פירוק מאגר עם 0.05% של דטרגנט נתן תוצאות משביע. בנוסף, ספינינג הגרעינים בדלי-הנדנדה במקום הרוטור זווית קבועה מותר לצמצם את כוח G 500, אשר מופחת במיטוכונדריה בגדר. חוקרים עשויים לבדוק גם סוגים אחרים של חומרי ניקוי, למשל, digitonin17. אולם, אפילו עם תנאים אופטימליים פירוק, זיהום mtDNA הוא בלתי נמנע. כדי להסיר לחלוטין את mtDNA, מערכת CRISPR/Cas9 יכול להיות בשימוש15. במקרה זה, ספריות האטא ק-seq מודגרת עם sgRNAs ועד היעד mtDNA נוקלאז Cas9 לעכל mtDNA15.
ייתכן צריכה להגביל מספר גרעינים הנדרש עבור פרוטוקול זה האטא ק-seq (100,000) במקרים בהם מספר הטלפון הנייד מדגימות קליני נדיר7. האטא ק-seq יש כבר בהצלחה טיפסו עד 5,000 ו 500 תאים1,13,17 על-ידי הפחתת התגובה נפח1,13, ביצוע ניקוי עם חרוזים מגנטי במקום עם עמודות 13, או הימנעות ניקוי שלב1. בנוסף, תא בודד האטא ק-seq (scATAC-seq) ניתן לבצע באמצעות מכשיר microfluidic להפרדת הגרעינים בודדים16. ראוי לציין, שיטות אחרות למדידת כרומטין נגישות, כגון DNase-seq שלהם-seq, דורשים יותר חומר המוצא עוד כמה ימים כדי לבצע את הניסוי.
. זה עכשיו נרחב מוערך כי הטיות בשיטות הגדרות שונות הן תופעות נפוצות25 אחד הגורמים וריאציות שונות כרומטין נגישות אמצעים הוא שלב המחשוף אנזימטי25. הוכח כי DNase אני מראה המחשוף הסטייה26 , עכשיו הוא מוכר כי Tn5 transposase מראה העדפה המחשוף וכן27. למרבה המזל, הטיה פוטנציאליים ניתן לזהות שהמפתחות באמצעות צינור בקרת איכות כגון ChiLin28. מקור נפוץ נוסף של הטיה הוא20,25שלב הגברה PCR. זה לעתים קרובות בא לידי ביטוי דעה קדומה על ההגברה של GC-עשיר קטעים25. מאז הטיה עולה עם כל צעד הגברה PCR, אנחנו לא יעלה על 9 מחזורים נוספים (N) בהגברה PCR הסופי של ספריות האטא ק-seq.
היחס הנכון בין Tn5 transposase הגרעינים הוא קריטי עבור האטא ק-seq מוצלחת2. עודף של אנזים יוביל "מעל טרנספוזיציה" לוקוסים לא נגיש, רקע. זה משתקף בשיעור גבוה הגברה של האזורים בקרה שלילית בשלב בקרת איכות qPCR. עודף של גרעינים יוביל "טרנספוזיציה התחתון". במקרה זה, אתרי המחשוף רחוקים מידי תגרום פחות שברי מוגבר-PCR והמורכבות ספריה נמוכה. כדי לקבוע את מספר גרעינים במדויק, הצגנו הספירה צעד נוסף לאחר פירוק התא, לפני התגובה טרנספוזיציה.
כרומטין נגישות הוא רובד חשוב רגולטוריות epigenetic היא מתירה את הפעילות של שעתוק regulators במיקומים ספציפיים גנומית. לפיכך, רצף הדנ א בתוך הפרופיל כרומטין נגיש מספק שפע של מידע אודות לוקוסים זהותו ואת היעד של עשרות גורמי שעתוק אפשרי. שילוב של מידע זה (מתקבל על ידי האטא ק-seq) עם פרופיל ביטוי של RNA מאפשר דגש על הגורמים הרלוונטיים שעתוק מסוגל לנתח עוד יותר על ידי שבב-seq13,22. בנוסף, הם רק 10% של המחלה-הקשורים פולימורפיזמים הגנום קידוד30. וכך החלה האטא ק-seq על דגימות קליני יכול לחשוף אשר וריאנטים ללא קידוד הינם אלמנטים רגולטוריים שעשויים להשפיע על הכונה במצב המחלה (למשל, בזאבת אדמנתית מערכתית-8). אנו מקווים כי הפרוטוקול האטא ק-seq לעזור ולעודד חוקרים מעוניין להשתמש בשיטה זו עוצמה כדי לקדם את המחקר שלהם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכת על ידי הקרן הלאומית למדע (גרנט 748/14), מארי קירי אינטגרציה הענק (סיגריה) - האיחוד FP7-אנשים-20013-סיגריה-618763 ואני-ליבת התוכנית של תכנון, תקצוב הוועדה ושל קרן המדע ישראל להעניק מס 41/11.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50 mL tubes | Lumitron | LUM-CFT011500-P | Can be from other vendors. |
| Microtubes | Axygen Inc | MCT-175-C | Can be from other vendors. |
| 25 mL serological pipettes | Corning Costar | 4489 | Can be from other vendors. |
| Tissue culture flask | Lumitron | LUM-TCF-012-250-P | Can be from other vendors. |
| Countes Automated Cell Counter | Invitrogen | C10227 | |
| NucleoSpin Tissue | MACHEREY-NAGEL | 740952.5 | |
| Peripheral blood mononuclear cells (PBMC) | ATCC | PCS800011 | Can be from other vendors. |
| RPMI 1640 Medium | Biological Industries | 01-103-1A | Can be from other vendors. |
| L-Glutamine Solution (200 mM) | Biological Industries | 03-020-1B | Can be from other vendors. |
| Penicillin-Streptomycin | Biological Industries | 03-031-1B | Can be from other vendors. |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated, European Grade | Biological Industries | 04-127-1 | Can be from other vendors. |
| MACS CD4 microbeads, human | Miltenyi Biotec | 130-045-101 | |
| MACS MS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Anti-Human CD4 FITC | Biogems | 06121-50 | |
| Mouse IgG1 Isotype Control FITC | Biogems | 44212-50 | |
| Anti-Human CD3 (OKT3) | Tonbo biosciences | 40-0037 | |
| Anti-Human CD28 SAFIRE Purified | Biogems | 10311-25 | |
| Recombinant Human IL2 | Peprotech | 200-02 | |
| Recombinant Human IL4 | Peprotech | 200-04 | |
| Recombinant Human IL12 p70 | Peprotech | 200-12 | |
| In Vivo Ready Anti-Human IL-4 (MP4-25D2) | Tonbo | 40-7048 | |
| LEAF Purified anti-human IFN-γ | BioLegend | 506513 | |
| NaCl, analytical grade | Carlo Erba | 479687 | Can be from other vendors. |
| Magnesium chloride, Hexahydrate, molecular biology grade | Calbiochem | 442611 | Can be from other vendors. |
| EDTA | MP Biomedicals | 800682 | Can be from other vendors. |
| Tris, ultra pure, 99.9% pure | MP Biomedicals | 819620 | Can be from other vendors. |
| NP-40 alternative (Nonylphenyl Polyethylene Glycol) | Calbiochem | 492016 | Can be from other vendors. |
| Protease Inhibitors | Sigma | P2714 | this protease inhibitor coctail is a powder. To make 100 x solution dilute in 1 mL of molecular-biology grade water. |
| Magnetic solid phase reverse immobilization beads: AMPure XP beads | Beckman | 63881 | |
| PCR purification kit | HyLabs | EX-GP200 | Can be from other vendors. |
| Nextera DNA Library Preparation Kit (TDE1 transposase and TD buffer) | Illumina | FC-121-1030 | |
| NEBNext High-Fidelity 2 x PCR Master Mix | New England BioLabs | M0541 | |
| NEBNext Q5 Hot Start HiFi PCR Master Mix | New England BioLabs | M0543 | |
| SYBR Green I | Invitrogen | S7585 | |
| CFX Connect Real-Time PCR Detection System | Bio-rad | 185-5200 | Can be from other vendors. |
| CFX Manager Software | Bio-rad | 1845000 | |
| master mix for qPCR: iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-rad | 172-5124 | Can be from other vendors. |
| Qubit fluorometer 2.0 | Invitrogen | Q32866 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen | Q32854 | |
| Magnet for eppendorf tubes | Invitrogen | 12321D | Can be from other vendors. |
| Swing bucket cooling centrifuge with the buckets for 15 mL falcon tubes and eppendorf tubes | Thermo Scientific | 75004527 | Could be from other vendors. It is important that it has buckets for eppendorf tubes. |
| Thermo-shaker | MRC | Can be from other vendors. | |
| High Sensitivity D1000 ScreenTape | Agilent Technologies | 5067-5584 | |
| High Sensitivity D1000 Reagents | Agilent Technologies | 5067-5585 | |
| 4200 TapeStation system | Agilent Technologies | G2991AA | Tape-based platform for electrophoresis |
| High Sensitivity DNA kit | Agilent Technologies | 5067-4626 | Reagent for high-sensitivity TapeStation analysis |
| Primer name and sequence | Company | ||
| Ad1_noMX: 5'-AATGATACGGCGACCACCGAGA TCTACACTCGTCGGCAGCGTC AGATGTG-3' |
IDT | Ad1-noMx: 5'-P5 sequence-transposase sequence-3' | |
| Ad2.1_TAAGGCGA: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG AT[TCGCCTTA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.1_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.2_CGTACTAG: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG AT[CTAGTACG]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.2_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.3_AGGCAGAA: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[TTCTGCCT]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.3_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.4_TCCTGAGC: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG AT[GCTCAGGA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.4_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.5_GGACTCCT: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[AGGAGTCC]GTCTCGTGGG CTCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.5_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.6_TAGGCATG: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[CATGCCTA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.6_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.7_CTCTCTAC: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[GTAGAGAG]GTCTCGTGGG CTCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.7_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.8_CAGAGAGG: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[CCTCTCTG]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.8_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.9_GCTACGCT: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[AGCGTAGC]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.9_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.10_CGAGGCTG: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACG AGAT[CAGCCTCG]GTCTCGTGG GCTCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.10_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.11_AAGAGGCA: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACG AGAT[TGCCTCTT]GTCTCGTGGG CTCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.11_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.12_GTAGAGGA: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACG AGAT[TCCTCTAC]GTCTCGTGGG CTCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.12_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.13_GTCGTGAT: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[ATCACGAC]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.13_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.14_ACCACTGT: 5'- CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[ACAGTGGT]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.14_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.15_TGGATCTG: 5'- CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[CAGATCCA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.15_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.16_CCGTTTGT: 5'- CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[ACAAACGG]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.16_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.17_TGCTGGGT: 5'- CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[ACCCAGCA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.17_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.18_GAGGGGTT: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[AACCCCTC]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.18_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.19_AGGTTGGG: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[CCCAACCT]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.19_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.20_GTGTGGTG: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[CACCACAC]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.20_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.21_TGGGTTTC: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[GAAACCCA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.21_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.22_TGGTCACA: 5'- CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[TGTGACCA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.22_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.23_TTGACCCT: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[AGGGTCAA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.23_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.24_CCACTCCT: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[AGGAGTGG]GTCTCGTGGG CTCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.24_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| F1: 5'-CCTTTTTATTTGCCCATACACTC-3' | IDT | ||
| R1: 5'-CCCAGATAGAAAGTTGGAGAGG-3' | IDT | ||
| F2: 5'-TTGAGGGATGCCATAACAGTC-3' | IDT | ||
| R2: 5'-CTGCTGAACAACATCCTTCAC-3' | IDT | ||
| F3: 5'-GGTTTGCAGGTTGCGTTG-3' | IDT | ||
| R3: 5'-AGAGGAATCTGGGAGTGACG-3' | IDT | ||
| F4: 5'-TGCTCATTCCGTTTCCCTAC-3' | IDT | ||
| R4: 5'-AGCCGGAAAGAAAGTTCCTG-3' | IDT |
References
- Buenrostro, J. D., Giresi, P. G., Zaba, L. C., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position. Nat Methods. 10 (12), 1213-1218 (2013).
- Buenrostro, J. D., Wu, B., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. ATAC-seq: A method for assaying chromatin accessibility genome-wide. Curr Protoc Mol Biol. , 21.29.1-21.29.9 (2015).
- Thurman, R. E., Rynes, E., et al. The accessible chromatin landscape of the human genome. Nature. 489 (7414), 75-82 (2012).
- Song, L., Crawford, G. E. DNase-seq: a high-resolution technique for mapping active gene regulatory elements across the genome from mammalian cells. Cold Spring Harb Protoc. (2), (2010).
- Simon, J. M., Giresi, P. G., Davis, I. J., Lieb, J. D. Using formaldehyde-assisted isolation of regulatory elements (FAIRE) to isolate active regulatory DNA. Nat Protoc. 7 (2), 256-267 (2012).
- Cui, K., Zhao, K. Genome-Wide Approaches to Determining Nucleosome Occupancy in Metazoans Using MNase-Seq. Methods Mol Biol. 833, 413-419 (2012).
- Qu, K., et al. Individuality and Variation of Personal Regulomes in Primary Human T Cells. Cell Syst. 1 (1), 51-61 (2015).
- Scharer, C. D., et al. ATAC-seq on biobanked specimens defines a unique chromatin accessibility structure in naïve SLE B cells. Sci Rep. 6, 27030 (2016).
- Sebé-Pedrós, A., et al. The Dynamic Regulatory Genome of Capsaspora and the Origin of Animal Multicellularity. Cell. 165 (5), 1224-1237 (2016).
- Lu, Z., Hofmeister, B. T., Vollmers, C., DuBois, R. M., Schmitz, R. J. Combining ATAC-seq with nuclei sorting for discovery of cis-regulatory regions in plant genomes. Nucleic Acids Res. 45 (6), e41 (2016).
- Davie, K., et al. Discovery of Transcription Factors and Regulatory Regions Driving In Vivo Tumor Development by ATAC-seq and FAIRE-seq Open Chromatin Profiling. PLOS Genet. 11 (2), (2015).
- Villar, D., et al. Enhancer Evolution across 20 Mammalian Species. Cell. 160 (3), 554-566 (2015).
- Lara-Astiaso, D., et al. Chromatin state dynamics during blood formation. Science. 345 (6199), 943-949 (2014).
- Prescott, S. L., et al. Enhancer Divergence and cis-Regulatory Evolution in the Human and Chimp Neural Crest. Cell. 163 (1), 68-83 (2015).
- Wu, J., et al. The landscape of accessible chromatin in mammalian preimplantation embryos. Nature. 534 (7609), 652-657 (2016).
- Buenrostro, J. D., et al. Single-cell chromatin accessibility reveals principles of regulatory variation. Nature. 523 (7561), 486-490 (2015).
- Corces, M. R., et al. Lineage-specific and single-cell chromatin accessibility charts human hematopoiesis and leukemia evolution. Nat Genet. 48 (10), 1193-1203 (2016).
- Jenner, R. G., et al. The transcription factors T-bet and GATA-3 control alternative pathways of T-cell differentiation through a shared set of target genes. Proc Natl Acad Sci USA. 106 (42), 17876-17881 (2009).
- DeAngelis, M. M., Wang, D. G., Hawkins, T. L. Solid-phase reversible immobilization for the isolation of PCR products. Nucleic Acids Res. 23 (22), 4742-4743 (1995).
- Aird, D., et al. Analyzing and minimizing PCR amplification bias in Illumina sequencing libraries. Genome Biol. 12 (2), R18 (2011).
- Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biol. 10 (3), R25 (2009).
- Li, H., Handsaker, B., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).
- Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).
- Zhang, Y., et al. Model-based Analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biol. 9 (9), R137 (2008).
- Meyer, C. A., Shirley Liu, X. Identifying and mitigating bias in next-generation sequencing methods for chromatin biology. Nat Rev Genet. 15 (11), 709-721 (2014).
- He, H. H., et al. Refined DNase-seq protocol and data analysis reveals intrinsic bias in transcription factor footprint identification. Nat Methods. 11 (1), 73-78 (2013).
- Madrigal, P. On Accounting for Sequence-Specific Bias in Genome-Wide Chromatin Accessibility Experiments: Recent Advances and Contradictions. Front Bioeng Biotechnol. 3, 1-4 (2015).
- Qin, Q., et al. ChiLin: a comprehensive ChIP-seq and DNase-seq quality control and analysis pipeline. BMC Bioinformatics. 17 (1), (2016).
- Bao, X., et al. A novel ATAC-seq approach reveals lineage-specific reinforcement of the open chromatin landscape via cooperation between BAF and p63. Genome Biol. 16 (1), 284 (2015).
- Maurano, M. T., et al. Systematic localization of common disease-associated variation in regulatory DNA. Science. 337 (6099), 1190-1195 (2012).
