Summary
उच्च प्रवाह अनुक्रमण (ATAC-seq) के साथ युग्मित Transposase-सुलभ क्रोमेटिन के लिए परख सुलभ क्रोमेटिन को उजागर करने के लिए एक जीनोम चौड़ा तरीका है । यह एक कदम दर कदम ATAC-seq प्रोटोकॉल, आणविक से अंतिम गणना विश्लेषण करने के लिए, मानव लिम्फोसाइटों (Th1/Th2) के लिए अनुकूलित है । इस प्रोटोकॉल अगली पीढ़ी के अनुक्रमण तरीकों में पूर्व अनुभव के बिना शोधकर्ताओं द्वारा अपनाया जा सकता है ।
Abstract
उच्च-प्रवाह अनुक्रमण के साथ Transposase-सुलभ क्रोमेटिन के लिए परख (ATAC-seq) एक विधि क्रोमेटिन के खुले (पहुंच योग्य) क्षेत्रों की पहचान के लिए उपयोग किया जाता है । इन क्षेत्रों विनियामक डीएनए तत्वों (जैसे, प्रवर्तकों, बढ़ाने, लोकस नियंत्रण क्षेत्रों, इंसुलेटर) का प्रतिनिधित्व करने के लिए जो प्रतिलेखन कारकों बांध । सुलभ क्रोमेटिन लैंडस्केप मानचित्रण जीनोम भर में सक्रिय नियामक तत्वों को उजागर करने के लिए एक शक्तिशाली दृष्टिकोण है । यह जानकारी प्रासंगिक प्रतिलेखन कारकों और क्रोमेटिन संरचना है कि जीन अभिव्यक्ति कार्यक्रम शासन के तंत्र के नेटवर्क की खोज के लिए एक निष्पक्ष दृष्टिकोण के रूप में कार्य करता है । ATAC-seq DNase के लिए एक मजबूत और संवेदनशील विकल्प है मैं अतिसंवेदनशीलता अगली पीढ़ी के अनुक्रमण के साथ युग्मित विश्लेषण (DNase-seq) और formaldehyde के जीनोम-व्यापक विश्लेषण के लिए विनियामक तत्वों (faire-seq) की सहायता से अलगाव क्रोमेटिन nucleosome स्थिति निर्धारण करने के लिए पहुँच क्षमता और micrococcal nuclease-संवेदी साइट्स (MNase-seq) के sequencing करने के लिए । हम मानव प्राथमिक प्रतिरक्षा कोशिकाओं अर्थात् सीडी + लिम्फोसाइटों (टी हेल्पर 1 (Th1) और Th2 कोशिकाओं) के लिए अनुकूलित एक विस्तृत ATAC-seq प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं । इस व्यापक प्रोटोकॉल सेल हार्वेस्ट के साथ शुरू होता है, तो क्रोमेटिन tagmentation, अगली पीढ़ी के अनुक्रमण के लिए नमूना तैयार करने की आणविक प्रक्रिया का वर्णन है, और भी तरीकों और गणना के लिए इस्तेमाल किया विश्लेषण के लिए विचार शामिल परिणामों की व्याख्या । इसके अलावा, समय और पैसे बचाने के लिए, हम अनुक्रमण करने से पहले ATAC-seq पुस्तकालय का आकलन करने के लिए गुणवत्ता नियंत्रण उपायों की शुरुआत की । महत्वपूर्ण बात, इस प्रोटोकॉल में प्रस्तुत सिद्धांतों अंय मानव प्रतिरक्षा और गैर प्रतिरक्षा प्राथमिक कोशिकाओं और सेल लाइनों के लिए अपने अनुकूलन की अनुमति देते हैं । ये दिशानिर्देश उन प्रयोगशालाओं के लिए भी उपयोगी होंगे जो अगली पीढ़ी के अनुक्रमण विधियों के साथ कुशल नहीं हैं ।
Introduction
ATAC-seq1,2 एक मजबूत तरीका है कि विनियामक3 खुले क्रोमेटिन क्षेत्रों और nucleosome स्थिति की पहचान में सक्षम बनाता है । यह जानकारी स्थान, पहचान, और प्रतिलेखन कारकों की गतिविधि को संदर्भित करने के लिए लागू किया जाता है । क्रोमेटिन संरचना में मात्रात्मक विविधताओं को मापने के लिए विधि की संवेदनशीलता क्रोमेटिन रिमॉडलर और संशोधक सहित क्रोमेटिन कारकों की गतिविधि के अध्ययन की अनुमति देता है, साथ ही आरएनए पोलीमरेज़ II1की transcriptional गतिविधि । इस प्रकार ATAC-seq तंत्र है कि ब्याज की किसी भी कोशिका प्रकार में transcriptional विनियमन नियंत्रित करने के लिए एक शक्तिशाली और निष्पक्ष दृष्टिकोण प्रदान करता है । हम प्राथमिक मानव Th1 और Th2 कोशिकाओं को ATAC-seq के अनुकूलन का वर्णन करते हैं ।
ATAC-seq में, अतिसक्रिय Tn5 transposase के लिए अनुकूलक के साथ भरी हुई अगली पीढ़ी के अनुक्रमण (NGS) के साथ डीएनए की टैगिंग जोड़ों डीएनए विखंडन (यानी, "tagmentation" प्रक्रिया)1। पीसीआर प्रवर्धन के बाद, परिणामी डीएनए पुस्तकालयों अगली पीढ़ी के अनुक्रमण के लिए तैयार कर रहे हैं (चित्रा 1). ATAC-seq अनुक्रमण के स्थानीय संवर्धन के विश्लेषण द्वारा सुलभ क्रोमेटिन के अधिमानी tagmentation का पता लगाया जाता है ।
लघु प्रयोगात्मक प्रक्रिया और कम शुरू सामग्री के लिए आवश्यकता, क्रोमेटिन पहुंच और nucleosomal स्थिति को मापने के लिए अंय तरीकों के सापेक्ष जैसे DNase-seq4, faire-seq5, और MNase-seq6, है मानव प्राथमिक कोशिकाओं1,7 और नैदानिक नमूने8, साथ ही कोशिकीय जीवों9, पौधों10, फल मक्खियों सहित कई जैविक प्रणालियों में ATAC-seq के उपयोग को बढ़ावा11 , और विभिन्न स्तनधारी12।
प्रतिलेखन कारकों की पहचान जो सुलभ loci के लिए बाध्य कर रहे हैं उनके बाध्यकारी अनुक्रम रूपांकनों के संवर्धन का विश्लेषण या क्रोमेटिन immunoprecipitation (चिप) उच्च प्रवाह डीएनए sequencing द्वारा पीछा के साथ ATAC-seq के संयोजन के द्वारा खुला किया जा सकता है ( चिप-seq) । इस दृष्टिकोण से वंश की पहचान-विशिष्ट प्रतिलेखन कारकों माउस में hematopoiesis के लिए महत्वपूर्ण सक्षम13. ATAC के निष्पक्ष और वैश्विक प्रकृति-seq जीवों में जीन विनियमन का अध्ययन करने की अनुमति देता है जिसके लिए एजेंट जैसे चिप विश्लेषण के लिए एंटीबॉडी उपलब्ध नहीं हैं । उदाहरण के लिए, सीआईएस-विनियामक क्षेत्रों में विकासवादी रूपांतरों मानव और चिंपांजी14, जल्दी माउस के दौरान नियामक तत्वों में विकासात्मक बदलाव से कपाल तंत्रिका शिखा कोशिकाओं का अध्ययन करके पहचान की गई है embryogenesis15, कोशिकीय सी owzarzaki9के जीवन चक्र के दौरान विनियामक परिदृश्य में परिवर्तन, और 20 स्तनधारियों प्रजातियों12भर में प्रवर्तकों और बढ़ाने के विकास ।
ATAC-seq भी एकल कोशिकाओं में क्रोमेटिन पहुंच को मापने के लिए महत्वपूर्ण भूमिका निभाई है, इस प्रकार कोशिका आबादी है, जो आम तौर पर जीनोम-वाइड अध्ययन7,16से बच के भीतर परिवर्तनशीलता खुलासा । इसके अलावा, ATAC-seq रोग की स्थिति में डीएनए विनियामक क्षेत्रों में होने वाले परिवर्तनों का अध्ययन किया जा सकता है, जिसमें नमूने दुर्लभ हैं. उदाहरण के लिए, ATAC-seq तीव्र माइलॉयड ल्यूकेमिया (एएमएल)17 या राससंचालित oncogenesis11की शुरुआत के दौरान विनियामक परिदृश्य में परिवर्तन का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
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Protocol
- गल 1 ५० मिलीलीटर ट्यूब में मानव PBMCs (10 7 कोशिकाओं) के 10 मिलीलीटर RPMI मध्यम के साथ पूरक 1% पेनिसिलिन-Streptomycin, 2 मिमी L-glutamine और 10% गर्मी निष्क्रिय भ्रूण गोजातीय सीरम । 5 मिनट के लिए ५०० x g पर केंद्रापसारक । supernatant निकालें और पूरक RPMI मध्यम के 15 मिलीलीटर में एक बाँझ 25 मिलीलीटर पिपेट के साथ कोशिकाओं को पुनर्स्थगित । कोशिकाओं को हस्तांतरण (बाँझ के साथ 25 मिलीलीटर पिपेट) एक T75 संस्कृति कुप्पी के लिए.
- एक humidified मशीन में रातोंरात कोशिकाओं को छोड़ (३७ & #176; C, 5% कं 2 ).
- एक बाँझ 25 मिलीलीटर पिपेट ५० मिलीलीटर ट्यूब के साथ अस्थायी कोशिकाओं हस्तांतरण. नीले अपवर्जन trypan द्वारा सेल संख्या और व्यवहार्यता का निर्धारण ।
- अलग सीडी + कोशिकाओं से १०,०००,००० लाइव गैर अनुयाई PBMCs सकारात्मक चयन द्वारा सीडी + microbeads और कॉलम का उपयोग कर निर्माता के अनुसार & #39; s सिफारिशें (देखें सामग्री/उपकरण के तालिका) निम्नलिखित के साथ संशोधन: 10 7 PBMCs के साथ लेबल किए गए हैं 30 & #181; l के सीडी microbeads में १२० & #181; के एल के ०.५% BSA में पंजाब.
- सक्रिय सीडी + टी कोशिकाओं के लिए ७२ ज द्वारा rhIL-2 (10 एनजी/एमएल), प्लेट बंधे विरोधी CD3 (5 & #181; जी/एमएल) और घुलनशील विरोधी CD28 (2 & #181; g/एमएल) । Th1 ध्रुवीकरण के लिए, rhIL-12 (20 एनजी/एमएल) और एंटी आईएल-4 (10 & #181; g/ml) जोड़ें । Th2 ध्रुवीकरण के लिए, add rhIL-4 (४० एनजी/एमएल) और एंटी IFN-& #947; (10 & #181; g/ml).
- संस्कृति rhIL-2 की उपस्थिति में अतिरिक्त 7 दिनों के लिए कोशिकाओं (10 एनजी/एमएल) और वही ध्रुवीकरण साइटोकिंस (rhIL के लिए Th1 और rhIL-4 Th2 के लिए).
नोट: lysis बफ़र (10 mm Tris-HCl, pH ७.५, 10 mm NaCl, 3 mm MgCl 2 ) तैयार करें । एक स्विंग-बाल्टी रोटर के साथ 4 & #176 के लिए एक केंद्रापसारक नीचे ठंडा; C. एक स्विंग-बाल्टी के बजाय एक निश्चित कोण केंद्रापसारक के केंद्रापसारक में कोशिकाओं छर्रों सेल/नाभिक नुकसान कम कर देता है । नाभिक या कोशिका हानि से बचने के लिए supernatant को त्यागते समय सावधानी प्लास्टिक.
- जोड़ें ताजा nonylphenyl पॉलीथीन ग्लाइकोल (०.०५% की एक अंतिम एकाग्रता के लिए) और 100x चिढ़ा अवरोधकों (1x के एक अंतिम एकाग्रता के लिए) ठंड lysis बफर को तुरंत उपयोग करने से पहले । बर्फ पर बफर रखें.
- टी कोशिकाओं की गणना करने के लिए उनकी राशि और trypan ब्लू विधि का उपयोग व्यवहार्यता का निर्धारण । व्यवहार्यता जो उच्च गैर विशिष्ट पाचन में ९०% परिणाम से कम है ।
- अंतरण ०.५ x 10 6 टी कोशिकाओं (Th1 या Th2) से १.५ मिलीलीटर microtubes । 5 मिनट के लिए ५०० x g पर नीचे स्पिन 4 & #176; C.
- कोल्ड फास्फेट के 1 मिलीलीटर में सेल गोली reसस्पेंड-बफर खारा (पंजाब) समाधान । 5 मिनट के लिए ५०० x g पर नीचे स्पिन 4 & #176; C.
- ठंड lysis बफर के 1 मिलीलीटर में सेल गोली reसस्पेंड (nonylphenyl पॉलीथीन ग्लाइकोल और चिढ़ा अवरोधकों) युक्त । बर्फ पर ट्यूब रखें । नाभिक को बाधित करने से बचने के लिए धीरे से पिपेट ।
- जल्दी ले 10 & #181; L और एक स्वचालित सेल काउंटर के साथ कोशिकाओं की गिनती जबकि लीजड कोशिकाओं के साथ microtube बर्फ पर है. यह कदम नाभिक को नुकसान पहुंचाने से बचने के लिए पांच मिनट से अधिक नहीं होना चाहिए । कक्षों में कम से ८०% लीजड होना चाहिए ।
- स्थानांतरण प्रतिक्रिया के साथ तुरंत जारी रखें । तैयार नाभिक को बर्फ पर रखें ।
- एक थर्मल शेखर में तापमान सेट ३७ & #176; ग.
- अंतरण १००,००० नाभिक से एक १.५ मिलि microtube.
- केंद्रापसारक पर ५०० x g के लिए 10 मिनट में 4 & #176; C और धीरे से निकाल supernatant.
- जोड़ें स्थानांतरण प्रतिक्रिया घटक नाभिक तालिका 1 . में निर्दिष्ट के रूप में कोमल pipetting द्वारा
- reसस्पेंड.
- ३७ & #176 पर एक थर्मल शेखर में स्थानांतरण प्रतिक्रिया मशीन, कोमल मिलाते (५०० rpm) के साथ 30 मिनट के लिए सी ।
नोट: डीएनए सफाई ठोस चरण प्रतिवर्ती स्थिरीकरण मोतियों द्वारा किया जाता है < सुप क्लास = "xref" > 19 (देखें टेबल की सामग्री/उपकरण ) या पीसीआर शुद्धि कॉलम । क्लीनअप के अंत में डीएनए अंशों को elute में 20 & #181; एल के 10 एमएम Tris-एचसीएल, पीएच 8 में । रेफरेंस बफर में EDTA से बचें.
- प्रारम्भिक पीसीआर प्रवर्धन
नोट: प्राइमरी की वर्किंग एकाग्रता 1 (Ad1_noMx) और प्राइमरी 2 है 25 & #181; एम. सभी प्राइमरों १०० के मूल स्टॉक से पतला कर रहे हैं & #181; मी ते २५ & #181; मी. पीसीआर प्रतिक्रियाओं के सभी में, प्राइमर 1 का उपयोग करें (Ad1_noMx) और अनुक्रमित प्राइमर 2 में से केवल एक ।- एक बाँझ पीसीआर ट्यूब करने के लिए तालिका 2 में निर्दिष्ट के रूप में पीसीआर प्रतिक्रिया के घटक जोड़ें.
- एक थर्मल साइकिल चालक में जगह पीसीआर ट्यूब और तालिका 3 . में विस्तृत सायक्लिंग शर्तों का उपयोग पीसीआर प्रवर्धन प्रदर्शन
- अतिरिक्त प्रवर्धन चक्रों की संख्या का आकलन
नोट: अतिरिक्त पीसीआर चक्र की संख्या पुस्तकालय टुकड़े की पर्याप्त राशि उपज चाहिए चया GC और आकार पूर्वाग्रह से बचने के लिए छोटा सा है, जबकि एक सफल अगली पीढ़ी अनुक्रमण चलाने, < सुप वर्ग = "xref" > २० . अधिकतम पुस्तकालय टुकड़ा प्रवर्धन के लिए आवश्यक पीसीआर चक्र ( N ) की संख्या का निर्धारण मात्रात्मक पीसीआर (qPCR) द्वारा किया जाता है ।- पतला प्राइमर 1 (Ad1_noMx) और 2 (प्रारंभिक पुस्तकालय प्रवर्धन के लिए प्रयुक्त) से 25 & #181; मी ते ६.२५ & #181; m.
- तालिका 4 . में कहा गया के रूप में ऑप्टिकल पीसीआर ट्यूब या एक प्लेट के लिए घटकों को जोड़ने एक qPCR साधन और तालिका 5 .
में निर्दिष्ट के रूप में चक्र में जगह - अतिरिक्त प्रवर्धन चक्रों की अपेक्षित संख्या का अनुमान लगाने के लिए ( N ), x-अक्ष पर प्लॉट चक्र संख्या और सापेक्ष प्रतिदीप्ति (RFU) y-अक्ष पर.
- अतिरिक्त प्रवर्धन चक्र की संख्या ( N ) चक्र की संख्या के 1/3 है जिस पर qPCR प्रतिक्रिया पठार तक पहुंच गया है । < सबल वर्ग = "xfig" > चित्रा 2
- बढ़ाना शेष ४५ & #181; पीसीआर रिएक्शन के एल. एक पीसीआर ट्यूब एक थर्मल साइकिल चालक में कदम 4.1.2 से प्रवर्धन प्रतिक्रिया युक्त प्लेस । टेबल 6 में वर्णित पीसीआर प्रोग्राम चलाएं । प्रवर्धन चक्र की पहले से निर्धारित (step 4.2.5) संख्या का उपयोग करें ( N ).
नोट: उपयोग करने से पहले चुंबकीय मोती कमरे के तापमान 30 मिनट के लिए गर्म करने की अनुमति दें ।
तैयार ताजा ७०% nuclease में इथेनॉल-मुक्त पानी ।
- को मिलाकर चुंबकीय मोतियों को फिर से सस्पेंड कर
- जोड़ें nuclease-ATAC-seq पुस्तकालयों के लिए मुफ्त पानी (चरण 4.3.1 में प्राप्त.) और १०० को लाने के लिए & #181; L.
- Add ५० & #181; l (0.5 x) के reसस्पैंड डीएनए-बाइंडिंग चुंबकीय मोतियों की १०० & #181 करने के लिए; प्रवर्धित पुस्तकालयों के एल. ऊपर और नीचे से कम से pipetting 10 बार मिश्रण । कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए मशीन के नमूने । यदि आवश्यक हो, जल्दी नीचे स्पिन microtubes.
- supernatant से चुंबकीय मोतियों को अलग करने के लिए 2 मिनट के लिए एक उपयुक्त चुंबकीय स्टैंड पर ट्यूब जगह है । 2 मिनट के बाद, supernatant एक नया microtube. करने के लिए स्थानांतरण
- pipetting द्वारा supernatant की मात्रा को मापने और चुंबकीय मोतियों की 0.7 एक्स जोड़ें । ऊपर और नीचे से कम से pipetting 10 बार मिश्रण ।
- कमरे के तापमान पर 5 मिनट की मशीन । 2 min. के लिए एक चुंबकीय स्टैंड पर प्लेस
- 2 मिनट की मशीन के बाद, supernatant त्यागें । Add २०० & #181; L हौसले से बनाया ७०% इथेनॉल मोतियों को धोने के लिए जबकि ट्यूबों चुंबकीय स्टैंड पर हैं ।
- 30 एस के लिए चुंबक पर microtube रखने के लिए और फिर इथेनॉल त्यागें । दोहराएँ चरण 5.7. दो अंतिम इथेनॉल बहाकर लिए.
- पूरी तरह से शेष इथेनॉल को हटा दें और मोती हवा 5 मिनट के लिए शुष्क जबकि ट्यूब चुंबक पर है । यदि आवश्यक हो, संक्षेप में microtube स्पिन । एक p10 पिपेट टिप के साथ इथेनॉल के निशान निकालें.
- को चुंबक से microtube निकालें और इसमें 22 & #181, 10 एमएम के Tris-एचसीएल, पीएच 8 के एल. EDTA. युक्त बफर में ATAC-seq पुस्तकालयों का elute न करें
- कमरे के तापमान पर 2 मिनट के लिए ट्यूब मशीन और फिर चुंबकीय स्टैंड पर जगह है ।
- समाधान स्पष्ट होने पर, अंतरण 20 & #181; eluted पुस्तकालयों के L को एक नए बाँझ microtube.
- संग्रह का आकार चयनित ATAC-seq लाइब्रेरीज़ पर-20 & #176; C.
- -ATAC पुस्तकालयों की गुणवत्ता के सत्यापन के द्वारा वास्तविक समय पीसीआर Seq नोट: यह करने के लिए संकेत का आकलन करने के लिए महत्वपूर्ण है
-ATAC पुस्तकालयों के शोर अनुपात अगली पीढ़ी से पहले अनुक्रमण. यह मात्रात्मक पीसीआर (qPCR) का उपयोग कर सुलभ और दुर्गम loci से डीएनए अंशों के सापेक्ष राशि का निर्धारण करके किया जाता है. दुर्गम loci (नकारात्मक नियंत्रण, chr1:48137860-48137934 और chr1:193093748-193093827) प्राइमरी जोड़े 1 और 2 से परिलक्षित होते हैं । सुलभ loci (सकारात्मक नियंत्रण, chr19:30336166-30336253 और chr19:11546154-11546237) प्राइमरी जोड़े 3 और 4 से परिलक्षित होते हैं । पॉजिटिव और निगेटिव loci को क्रोमेटिन ऑप्शन्स (धस-seq) प्रोफाइल्स ऑफ ह्यूमन सीडी + सेल (एनकोडिंग एक्सेस्स ENCSR000EQE और ENCSR000EQG) से परिभाषित किया गया था । नेगेटिव प्राइमरी 1 एक बड़े heterochromatic intergenic क्षेत्र में स्थित है (TRADB2 से २३० kb और FOXD2 से ८८ kb) । नकारात्मक नियंत्रण क्षेत्र 2 CDC73 जीन के पहले intron के भीतर में है । सकारात्मक प्राइमर जोड़ी 3 Cyclin ई के एक खुले क्रोमेटिन क्षेत्र बहाव के भीतर (CCNE1) जीन है, जबकि सकारात्मक प्राइमर जोड़ी 4 प्रोटीन कळेनासे सी सब्सट्रेट 80K-एच (PRKCSH) के प्रवर्तक के भीतर केंद्रित है । महत्वपूर्ण रूप से, ये नियंत्रण loci अन्य मानव कोशिका प्रकारों में पहुँच-क्षमता के समान प्रतिमान को एनकोडिंग प्रोजेक्ट से दिखाएँ < सुप वर्ग = "xref" > ३ , सुझाव है कि वे मानव कोशिका प्रकार की एक व्यापक स्पेक्ट्रम से ATAC-seq पुस्तकालयों की निगरानी के लिए लागू किया जा सकता है. प्राइमर दक्षता और सभी प्राइमर जोड़े की विशिष्टता जीनोमिक डीएनए के एक धारावाहिक कमजोर पड़ने पर qPCR द्वारा सत्यापित किया गया था (मानव गु कोशिकाओं से) और प्राप्त प्रवर्धित उत्पादों के एक पिघलने वक्र विश्लेषण ।- अलग जीनोमिक डीएनए एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट का उपयोग कर (देखें सामग्री की तालिका/
- पतला प्रवर्धित ATAC-seq पुस्तकालय 1:10 (1 & #181; l तकालय + 9 & #181; l का nuclease-मुक्त जल) तथा जीनोमिक डीएनए को ~ 5 एनजी/& #181; l.
- एक सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण प्राइमरी जोड़ी के लिए प्रतिक्रिया मिश्रण ( तालिका 7 ) तैयार, खाते में ले कि प्रतिक्रियाओं तपसिल. में प्रदर्शन कर रहे हैं
- qPCR थर्मल साइकिल चालक में qPCR मास्टर मिक्स आपूर्तिकर्ता द्वारा अनुशंसित प्रोटोकॉल के अनुसार मशीन ।
- qPCR लिखत & #39; s सॉफ्टवेयर में परिणाम का विश्लेषण (देखें सामग्री/उपकरण ) । एक नियंत्रण नमूना के रूप में जीनोमिक डीएनए चुनें । प्राप्त मूल्यों (सकारात्मक नियंत्रण प्राइमरों से परिलक्षित) सुलभ क्षेत्रों की एक समृद्ध प्रतिनिधित्व करते हैं । एक उदाहरण तालिका 8 .
में दिखाया गया है नोट: औसत पुस्तकालय के आकार और एकाग्रता का आकलन: ATAC-seq पुस्तकालयों से डीएनए टुकड़े का आकार वितरण उच्च संवेदनशीलता स्वचालित ट्रो सिस्टम द्वारा निर्माता & #39; s निर्देश के अनुसार निर्धारित होता है । यह dsDNA उच्च संवेदनशीलता किट का उपयोग करते हुए एक fluorometer पर नमूना एकाग्रता को मापने के लिए सलाह दी जाती है और प्रत्येक डीएनए नमूने के कम से कम 2 & #181; L.
नोट: अगली पीढ़ी के sequencing-पुस्तकालयों को मल्टीप्लेक्स करने से पहले, प्रत्येक ATAC-seq लाइब्रेरी के molarity को सूत्र का उपयोग करके परिकलित करें: (एनजी/& #181; L x 10 6 )/(६६० x औसत लायब्रेरी अंश लंबाई) । & #62 के लिए निशाना लगाओ; ३०,०००,००० प्रत्येक ATAC की पुस्तकें-seq पुस्तकालय का आकलन करने के लिए खुला क्रोमेटिन मानव नमूनों के क्षेत्र । यदि आप पुस्तकालय NGS अनुक्रमण के लिए काफी अच्छा है निर्धारित करने के लिए चाहते हैं, शुरू में ~ १०,०००,००० पढ़ता के लिए उद्देश्य (तेजी से चलाने के मोड में डीएनए अनुक्रमण साधन पर sequencing लेन का 5%). ध्यान रखें कि nucleosome पोजिशनिंग का अनुमान लगाने के लिए, युग्मित-अंत sequencing की आवश्यकता है < सुप क्लास = "xref" > 1 .
- अनुमान अनुक्रमण की गुणवत्ता FastQC फ़ाइलों का निरीक्षण करके, प्रत्येक लायब्रेरी के लिए अलग से पढ़ता है ।
- संरेखित करने के लिए मानव संदर्भ जीनोम (hg19 असेंबली) का उपयोग Bowtie < सुप वर्ग = "xref" > 21 Unix/Linux वातावरण में सॉफ्टवेयर । आदेश & #39; bowtie-m 1-q-S जीनोम निर्देशिका पढ़ता है । fastq output_aligned. sam & #39;. जीनोम निर्देशिका फ़ोल्डर जहां Bowtie के जीनोम अनुक्रमित जमा हो जाती है के लिए खड़ा है । पैरामीटर-m 1 की अनुमति नहीं दे रहा संरेखण के लिए है एक से अधिक लोकस के जीनोम में पढ़ता है,-q इनपुट फ़ाइल fastq स्वरूप में होना चाहिए के लिए है,-S आउटपुट है कि सैम स्वरूप में है के लिए है ।
- निकालें डुप्लिकेट SAMtools का उपयोग कर पढ़ता है < सुप वर्ग = "xref" > २२ rmdup विकल्प Unix/Linux वातावरण में । आज्ञा & #39; samtools दृश्य-S output_aligned. sam-b | samtools सॉर्ट-o-output_aligned & #62; output_aligned. bam & #39;,
samtools rmdup-s output_aligned. bam output_aligned _rmdup. bam & #39;. पहले आदेश, दृश्य, परिवर्तन SAM स्वरूप जो तब सॉर्ट किया जाता है BAM स्वरूप में है । rmdup का विकल्प हल BAM फ़ाइल पर लागू किया जाता है । वैकल्पिक रूप से एक transposon प्रविष्टि साइट के लिए पढ़ता समायोजित कर सकते हैं, मूल ATAC-seq पेपर में वर्णित के रूप में < सुप वर्ग = "xref" > १ . यह BEDtools आदेशों का उपयोग कर किया जाता है < सुप क्लास = "xref" > 23 in Unix/Linux वातावरण. आदेश & #39; bamToBed-i output_aligned _rmdup. bam & #62; output_aligned _rmdup. पलंग & #39;, & #39; shiftBed-i output_aligned _rmdup. पलंग-प 4-म-5-g जीनोम & #62; output_aligned _rmdup_adjusted. bed & #39;. पहला आदेश, bamTobed, जो तब shiftBed आदेश के लिए उपयोग किया जा सकता है बिस्तर स्वरूप में BAM स्वरूप बदलता है । जीनोम फ़ाइल एक टैब सीमांकित फ़ाइल है कि जीनोम में प्रत्येक गुणसूत्र की लंबाई शामिल है । फ़ाइल आमतौर पर BEDtools निर्देशिका में जोड़ा जाता है । - प्रदर्शन पीक कॉल मॉडल-आधारित विश्लेषण चिप-seq (MACS2) का उपयोग कर < सुप वर्ग = "xref" > 24 Unix/Linux वातावरण में सॉफ़्टवेयर निंन पैरामीटर के साथ स्थानांतरित बिस्तर फ़ाइल पर:--nomodel--extsize ७५--shift-30. इन पैरामीटर्स को समायोजित करने के लिए उपयोग किया जाता है ताकि transposon सम्मिलन साइट प्रत्येक sequencing पढ़ने के बीच में है ।
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Representative Results
इस प्रोटोकॉल के अंतिम परिणाम आमतौर पर 3-20 एनजी के एक ATAC-seq पुस्तकालय है/µ एल । जब डीएनए अखंडता विश्लेषण के लिए एक प्रणाली पर चलाने के लिए ( सामग्री की तालिका/देखें, वे सीढ़ी की तरह दिखाई देते है2 (आंकड़ा 3) । डीएनए अंशों का औसत आकार सामांयतया है ~ ४५०-५३० bp ।
अगली पीढ़ी के अनुक्रमण प्रदर्शन करने से पहले ATAC-seq पुस्तकालयों के उचित गुणवत्ता नियंत्रण समय और पैसा बचाने के लिए महत्वपूर्ण है । हम अगली पीढ़ी के अनुक्रमण के लिए उपयुक्त पुस्तकालयों पर विचार (NGS) जब सकारात्मक नियंत्रण के संवर्धन से अधिक है 25-और ७५-गुना (प्राइमर जोड़े 3 और 4 के लिए, क्रमशः) नकारात्मक नियंत्रण के सापेक्ष (चित्र बी) और जब वे शो पहले उल्लेख किया nucleosomal, सीढ़ी की तरह दिखाई । qPCR डेटा का विश्लेषण करते समय, हम यह भी सत्यापित कर रहे हैं कि नकारात्मक और सकारात्मक नियंत्रण प्राइमरों के लिए सीक्यू मूल्यों एक टेम्पलेट के रूप में जीनोमिक डीएनए के साथ प्रतिक्रियाओं में समान हैं और नकारात्मक नियंत्रण क्षेत्रों के लिए सीक्यू मूल्यों (ATAC-seq डीएनए के साथ प्रतिक्रियाओं में टुकड़े) प्रयोगों के बीच लगातार कर रहे हैं. उदाहरण के लिए, अचानक कम सीक्यू मूल्यों के मामले में, हमें संदेह है कि नाभिक पर स्थानांतरित कर रहे थे और इस तरह डीएनए heterochromatin क्षेत्रों से उत्पंन टुकड़े खत्म हो प्रतिनिधित्व कर रहे हैं । इसके अलावा, यदि जेल छवि (उच्च संवेदनशीलता टेप-आधारित ट्रो द्वारा प्राप्त) ATAC-seq पुस्तकालयों के एडेप्टर की उपस्थिति इंगित करता है (~ १२० बीपी), अत्यधिक डीएनए क्षरण (टुकड़े के बहुमत ~ २०० bp हैं), या बड़े टुकड़े (1 kb से अधिक), हम NGS चरण में जारी नहीं होता ।
इसके अलावा, हम हमेशा प्रारंभिक NGS जिसमें हम १०,०००,००० के लिए उद्देश्य पुस्तकालय प्रति पढ़ता है । इस sequencing के परिणाम संतोषजनक हैं, तो (नमूना FastQC रिपोर्ट फ़ाइल में सभी पैरामीटर्स को पास करता है और हम पीक कॉलिंग करने के बाद १०००-२००० चोटियों प्राप्त कर सकते हैं), लायब्रेरी और अधिक गहराई (३०,०००,००० से अधिक पढ़ता/ATAC-seq लायब्रेरी) अनुक्रम हैं ।
स्तनधारी कक्षों पर ATAC-seq प्रयोगों में, कहीं से भी ~ 30-70% से अनुक्रम में पढ़ता हैmtDNA10 से आ सकता है । इसके विपरीत, हमारे पुस्तकालयों निहित 6-20% mitochondrial जीनोम के लिए मैप पढ़ता है । यह मानव सीडी + टी लिम्फोसाइटों1से ATAC-seq पुस्तकालय में रिपोर्ट ४६% से कम है । इन दूषित पढ़ता को नष्ट करने के बाद, हम के साथ छोड़ दिया गया ~ 7-32 लाख अद्वितीय पढ़ता संदर्भ मानव जीनोम के लिए मानचित्रण (58%-९१% सभी पढ़ता है) । इन से, ०.१-२,०००,००० पुस्तकें (६.८%-सभी पढ़ता का 12%) ATAC-seq चोटियों में थे (चित्र 4) ।
चित्र 1 . प्रायोगिक चरणों का कार्यप्रवाह । इस ATAC-seq प्रोटोकॉल में प्रमुख चरणों का प्रतिनिधित्व । रोक अंक पीले षट्कोण द्वारा संकेत कर रहे हैं । एक वैकल्पिक चरण एक नारंगी षट्कोण के साथ प्रतिनिधित्व किया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्र 2 . ATAC-seq पुस्तकालयों के अंतिम संवर्धन के लिए आवश्यक पीसीआर चक्रों की अतिरिक्त संख्या की गणना. तीन अलग ATAC seq पुस्तकालयों के लिए पीसीआर प्रवर्धन घटता लाल, नीले और गुलाबी में दिखाए जाते हैं । प्रवर्धन प्रतिक्रियाओं २,३५० RFU पर एक पठार (ऊपरी हरे रंग की क्षैतिज रेखा) तक पहुंच गया । अतिरिक्त पीसीआर चक्रों की संख्या प्रवर्धन वक्र पर ७८३ RFU (2350/3) के साथ । दो पुस्तकालयों (लाल और नीले) 8 अतिरिक्त प्रवर्धन चक्र की आवश्यकता होती है, जबकि तीसरे पुस्तकालय (गुलाबी) 9 चक्र की आवश्यकता है । गैर-टेंपलेट नियंत्रण (एनटीसी) को कम हरी रेखा के रूप में दिखाया गया है । X-अक्ष, चक्र संख्या । Y-अक्ष, RFU इकाइयां । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्र 3 . ATAC-seq पुस्तकालयों की गुणवत्ता नियंत्रण विश्लेषण । (A) परिवर्धित ATAC-seq लायब्रेरीज़ के टेप-आधारित स्वचालित ट्रो के परिणाम । L, सीढ़ी; ए डी, Th1 और Th2 कोशिकाओं से जैविक दोहराने की पुस्तकालयों । (ख) ATAC-seq पुस्तकालयों का qPCR गुणवत्ता नियंत्रण विश्लेषण । जीनोमिक डीएनए और चार ATAC-seq पुस्तकालयों नकारात्मक नियंत्रण प्राइमर जोड़े (1 और 2) और सकारात्मक नियंत्रण प्राइमरों (3 और 4) द्वारा परिलक्षित किया गया । ATAC के लिए प्राप्त मूल्यों-seq पुस्तकालयों (नीला) पहले जीनोमिक डीएनए के प्रवर्धन स्तर को सामान्यीकृत थे (मनमाने ढंग से 1 के एक मूल्य के लिए सेट; लाल) । इसके बाद, धनात्मक नियंत्रण क्षेत्रों के लिए मान ऋणात्मक नियंत्रण क्षेत्रों (निचला चार्ट) पर सामान्यीकृत किए गए. पुस्तकालयों #1 और #2 NGS अनुक्रमण करने के लिए भेजा गया था । मूल्यों का प्रतिनिधित्व ± SEM मतलब है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्र 4 . जीनोम ब्राउज़र Th1 और Th2 कोशिकाओं में सुलभ क्रोमेटिन क्षेत्रों के snapsh ओटीएस । ATAC-seq पटरियों NFKB1, जून, CD28, IFNG (Th1 में ही व्यक्त) और IL4 और IL13 के लिए दिखाए जाते हैं (Th2 में ही व्यक्त) loci और Th1 कोशिकाओं में Th2 (प्रत्येक के लिए दो जैविक दोहराता). कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
| टीडी बफर | ५० | μl |
| TDE1 transposase | 5 | μl |
| Nuclease-मुफ्त पानी | ४५ | μl |
| कुल मात्रा | १०० | μl |
तालिका 1: स्थानांतरण प्रतिक्रिया मिश्रण की तैयारी ।
| ATAC-seq पुस्तकालय | 15 | μl |
| प्राइमरी 1 (Ad1_noMx) * | २.५ | μl |
तालिका 2: प्रारंभिक पीसीआर प्रतिक्रिया मिश्रण के घटक (कदम 5.1.1.) ।
| सायकल स्टेप | तापमान | समय | चक्र |
| एक्सटेंशन* | ७२ ° c | 5 min | 1 |
| प्रारंभिक विकार | ९८ ° c | 30 एस | |
| विकार | ९८ ° c | 10 एस | 5 |
| एनीलिंग | ६३ ° c | 30 एस | |
| एक्सटेंशन | ७२ ° c | 3 min | |
| पकड़ | 4 ° c | ∞ | |
| * यह कदम दोनों का विस्तार करने के लिए आवश्यक है | |||
| स्थानांतरण प्रतिक्रिया के बाद प्राइमरों के समाप्त होता है । | |||
तालिका 3: प्रारंभिक पुस्तकालय प्रवर्धन (step 5.1.2.) के लिए पीसीआर साइकलिंग शर्तें
| पीसीआर रिएक्शन की Aliquot (कदम शुू) * | 5 | μl |
| प्राइमरी 1 (Ad1_noMx) * * | 1 | μl |
| प्राइमरी 2 | 1 | μl |
| 2x SYBR मास्टर मिक्स * * * | ७.५ | μl |
| Nuclease-मुफ्त पानी | ०.५ | μl |
| कुल मात्रा | 15 | μl |
| * गैर के लिए-टेंपलेट नियंत्रण के बजाय डीएनए टेंपलेट अल्ट्रा शुद्ध पानी जोड़ें । | ||
| * * प्रत्येक प्राइमर के अंतिम एकाग्रता ४१७ एनएम है । | ||
| qPCR के लिए पसंदीदा मास्टर मिश्रण का उपयोग करें । | ||
| इसमें पोलीमरेज़, dNTPs, MgCl2, और फ्लोरोसेंट डाई शामिल होना चाहिए । | ||
तालिका 4: qPCR रिएक्शन मिक्सचर (step 5.2.2) तैयार करना ।
| सायकल स्टेप | तापमान | समय | चक्र |
| प्रारंभिक विकार | ९८ ° c | 30 एस | 1 |
| विकार | ९८ ° c | 10 एस | 20 |
| एनीलिंग | ६३ ° c | 30 एस | |
| एक्सटेंशन | ७२ ° c | 3 min | |
| पकड़ | 4 ° c | ∞ |
तालिका 5: प्रवर्धन चक्र की अतिरिक्त संख्या के qPCR आधारित आकलन के लिए सायक्लिंग शर्तों (N) (step 5.2.3.)
| सायकल स्टेप | तापमान | समय | चक्र |
| प्रारंभिक विकार | ९८ ° c | 30 एस | 1 |
| विकार | ९८ ° c | 10 एस | एन |
| एनीलिंग | ६३ ° c | 30 एस | |
| एक्सटेंशन | ७२ ° c | 3 min | |
| पकड़ | 4 ° c | ∞ |
तालिका 6: अंतिम पीसीआर संवर्धन कदम के लिए सायक्लिंग शर्तें (चरण ५.३.) ।
| एक एकल पीसीआर प्रतिक्रिया के लिए: | ||
| जीनोमिक डीएनए के पुस्तकालय के कमजोर पड़ने | २.५ | μl |
| 10 माइक्रोन प्राइमर एफ (F1 या F2 या F3 या F4) * | ०.३ | μl |
| 10 माइक्रोन प्राइमर आर (R1 या R2 या R3 या R4) * * | ०.३ | μl |
| 2x SYBR मास्टर मिक्स * * * | 5 | μl |
| Nuclease-मुफ्त पानी | १.९ | μl |
| कुल मात्रा | 10 | μl |
| * प्रतिक्रिया मिश्रण में प्रत्येक प्राइमर के अंतिम एकाग्रता ३०० एनएम है । | ||
| * * यदि आर प्राइमर से प्राइमर F1 का उपयोग कर R1 आदि होना चाहिए | ||
| पसंदीदा 2x मास्टर मिश्रण अपनी प्रयोगशाला में qPCR साधन के लिए उपयुक्त का उपयोग करें । | ||
तालिका 7: QC विश्लेषण (चरण 7.1.3.) के लिए प्रतिक्रिया शर्तें ।
| लक्ष्य | नमूना | निकृष्ट सीक्यू | सीक्यू SEM | सापेक्ष मात्रा | सामान्यीकृत | |
| 1 | नकारात्मक नियंत्रण | ATAC-seq | ३०.३९ | ०.११ | 1 | १.०१ |
| gDNA | ३०.४ | ०.१६ | ०.९९ | 1 | ||
| 2 | ATAC-seq | ३०.३ | ०.१८ | 1 | 1 | |
| gDNA | ३०.३४ | ०.०९ | ०.९९ | 1 | ||
| 3 | सकारात्मक नियंत्रण | ATAC-seq | २३.२७ | ०.०३ | 1 | १७३.१४ |
| gDNA | ३०.७ | ०.०६ | ०.०१ | 1 | ||
| 4 | ATAC-seq | २१.५५ | ०.२४ | 1 | ७५०.३१ | |
तालिका 8: नकारात्मक नियंत्रण (चरण 7.1.5.) पर सकारात्मक नियंत्रण के संवर्धन की गणना ।
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Discussion
यहां वर्णित ATAC-seq प्रोटोकॉल प्राथमिक कक्षों में सुलभ क्रोमेटिन के विश्लेषण के लिए सफलतापूर्वक नियोजित किया गया है (मानव Th1, Th2 कोशिकाओं, और बी कोशिकाओं) के साथ-साथ कल्चरल सेल लाइंस (MCF10A मानव स्तन कैंसर कोशिकाओं और U261 ग्लियोब्लास्टोमा कोशिकाओं). अन्य कक्ष प्रकारों के लिए ATAC-seq लागू कर रहा है कुछ प्रोटोकॉल ऑप्टिमाइज़ेशन, विशेष रूप से lysis चरण में पड़ सकता है । यदि गैर की एकाग्रता ईओण डिटर्जेंट बहुत अधिक है, वहां mitochondrial डीएनए संदूषण का एक उच्च प्रतिशत हो सकता है । इस नाभिक उपज को कम करने के बिना lysis बफर में डिटर्जेंट एकाग्रता कम करके कम किया जा सकता है । हमारे अनुभव में, डिटर्जेंट के ०.०५% के साथ lysis बफर सबसे संतोषजनक परिणाम दिया । इसके अलावा, एक झूले-बाल्टी में नाभिक कताई बजाय तय कोण रोटर ५००, जो गोली में mitochondria कम करने के लिए जी बल को कम करने की अनुमति दी । शोधकर्ताओं ने भी अंय प्रकार के डिटर्जेंट परीक्षण कर सकते हैं, उदाहरण के लिए, digitonin17। हालांकि, यहां तक कि अनुकूलित lysis शर्तों के साथ, mtDNA संदूषण अपरिहार्य है । mtDNA को पूरी तरह से निकालने के लिए, CRISPR/Cas9 सिस्टम को15का उपयोग किया जा सकता है । इस मामले में, ATAC-seq पुस्तकालयों sgRNAs के लिए लक्ष्य mtDNA और Cas9 nuclease mtDNA15पचाने के लिए के साथ मशीन हैं ।
इस ATAC-seq प्रोटोकॉल (१००,०००) के लिए आवश्यक नाभिक की संख्या उन मामलों में सीमित हो सकती है जहां नैदानिक नमूनों से कक्ष संख्या7दुर्लभ है । ATAC-seq सफलतापूर्वक ५,००० और ५०० कोशिकाओं के लिए नीचे किया गया है1,13,17 की प्रतिक्रिया मात्रा1,13को कम करके, चुंबकीय मोतियों के साथ सफाई प्रदर्शन के बजाय कॉलम के साथ 13, या क्लीनअप चरण1से बचना । इसके अतिरिक्त, एकल-कक्ष ATAC-seq (scATAC-seq) को अलग-अलग microfluidic16के लिए एक नाभिक डिवाइस का उपयोग कर किया जा सकता है । विशेष रूप से, क्रोमेटिन पहुंच को मापने के लिए अंय तरीकों, जैसे DNase-seq और साफ-seq, और अधिक शुरू सामग्री और कुछ और दिनों के प्रयोग करने की आवश्यकता है ।
अब यह व्यापक रूप से सराहना की है कि विभिंन NGS तरीकों में पूर्वाग्रहों आम घटनाएं है25। विभिन्न क्रोमेटिन पहुँच क्षमता उपायों में भिन्नता के लिए कारणों में से एक एंजाइमी क्लीवेज चरण25है । यह दिखाया गया है कि DNase मैं दरार26 पूर्वाग्रह से पता चलता है और अब यह मांयता प्राप्त है कि Tn5 transposase दरार वरीयता के रूप में अच्छी तरह से दिखाता है27। सौभाग्य से, संभावित पूर्वाग्रह इस तरह के ChiLin28के रूप में एक गुणवत्ता नियंत्रण पाइपलाइन का उपयोग करके गणना की पहचान की जा सकती है । पूर्वाग्रह का एक अंय आम स्रोत पीसीआर प्रवर्धन कदम20,25है । यह अक्सर GC-रिच अंशों के प्रवर्धन के लिए एक पूर्वाग्रह के रूप में प्रकट होता है25. हर पीसीआर प्रवर्धन कदम के साथ पूर्वाग्रह बढ़ जाती है के बाद से, हम ATAC-seq पुस्तकालयों के अंतिम पीसीआर प्रवर्धन में 9 अतिरिक्त चक्र (एन) से अधिक नहीं है ।
Tn5 transposase और नाभिक के बीच उचित अनुपात सफल ATAC-seq2के लिए महत्वपूर्ण है । एंजाइम की एक अतिरिक्त को दुर्गम loci और उच्च पृष्ठभूमि में "स्थानांतरण ओवर" का नेतृत्व करेंगे । यह qPCR गुणवत्ता नियंत्रण चरण में ऋणात्मक नियंत्रण क्षेत्रों के उच्च प्रवर्धन में प्रतिबिंबित होता है । नाभिक का एक अतिरिक्त करने के लिए नेतृत्व करेंगे "के तहत स्थानांतरण" । इस मामले में, बहुत दूर दरार साइटों कम पीसीआर-प्रवर्धित टुकड़े और कम पुस्तकालय जटिलता में परिणाम होगा । नाभिक की संख्या सही निर्धारित करने के लिए, हम सेल lysis के बाद एक अतिरिक्त गिनती कदम पेश किया और स्थानांतरण प्रतिक्रिया करने से पहले ।
क्रोमेटिन पहुंच एक महत्वपूर्ण epigenetic विनियामक परत है क्योंकि यह विशिष्ट जीनोमिक स्थानों पर प्रतिलेखन नियामकों की गतिविधि की अनुमति देता है । इस प्रकार, सुलभ क्रोमेटिन प्रोफ़ाइल के भीतर डीएनए अनुक्रम पहचान और संभव प्रतिलेखन कारकों के दसियों के लक्ष्य loci के बारे में जानकारी का खजाना प्रदान करता है । इस जानकारी के संयोजन (ATAC द्वारा प्राप्त-seq) एक आरएनए अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल के साथ प्रासंगिक प्रतिलेखन कारकों है कि आगे चिप द्वारा विश्लेषण किया जा सकता है पर ध्यान केंद्रित करने की अनुमति देता है-seq13,22. इसके अलावा, रोग के केवल 10% से जुड़े बहुरूपताओं कोडिंग जीनोम में कर रहे है30। इस प्रकार नैदानिक नमूनों के लिए ATAC-seq लागू करने का पता चलता है जो गैर कोडिंग कर सकते है वेरिएंट नियामक तत्वों है कि रोग राज्य में जीन विनियमन को प्रभावित कर सकता है (उदाहरण के लिए, प्रणालीगत एक प्रकार का वृक्ष वृक्ष8में) । हमें उंमीद है कि इस ATAC-seq प्रोटोकॉल में मदद मिलेगी और रुचि जांचकर्ताओं को प्रोत्साहित करने के लिए इस शक्तिशाली विधि का उपयोग करने के लिए अपने अनुसंधान अग्रिम ।
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Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
यह काम इसराइल विज्ञान फाउंडेशन द्वारा समर्थित है (अनुदान 748/14), मैरी क्यूरी एकीकरण अनुदान (CIG)-FP7-लोग-२००१३-CIG-६१८७६३ और मैं योजना और बजट समिति और इसराइल विज्ञान फाउंडेशन अनुदान no. 41/11 के कोर कार्यक्रम ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50 mL tubes | Lumitron | LUM-CFT011500-P | Can be from other vendors. |
| Microtubes | Axygen Inc | MCT-175-C | Can be from other vendors. |
| 25 mL serological pipettes | Corning Costar | 4489 | Can be from other vendors. |
| Tissue culture flask | Lumitron | LUM-TCF-012-250-P | Can be from other vendors. |
| Countes Automated Cell Counter | Invitrogen | C10227 | |
| NucleoSpin Tissue | MACHEREY-NAGEL | 740952.5 | |
| Peripheral blood mononuclear cells (PBMC) | ATCC | PCS800011 | Can be from other vendors. |
| RPMI 1640 Medium | Biological Industries | 01-103-1A | Can be from other vendors. |
| L-Glutamine Solution (200 mM) | Biological Industries | 03-020-1B | Can be from other vendors. |
| Penicillin-Streptomycin | Biological Industries | 03-031-1B | Can be from other vendors. |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated, European Grade | Biological Industries | 04-127-1 | Can be from other vendors. |
| MACS CD4 microbeads, human | Miltenyi Biotec | 130-045-101 | |
| MACS MS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Anti-Human CD4 FITC | Biogems | 06121-50 | |
| Mouse IgG1 Isotype Control FITC | Biogems | 44212-50 | |
| Anti-Human CD3 (OKT3) | Tonbo biosciences | 40-0037 | |
| Anti-Human CD28 SAFIRE Purified | Biogems | 10311-25 | |
| Recombinant Human IL2 | Peprotech | 200-02 | |
| Recombinant Human IL4 | Peprotech | 200-04 | |
| Recombinant Human IL12 p70 | Peprotech | 200-12 | |
| In Vivo Ready Anti-Human IL-4 (MP4-25D2) | Tonbo | 40-7048 | |
| LEAF Purified anti-human IFN-γ | BioLegend | 506513 | |
| NaCl, analytical grade | Carlo Erba | 479687 | Can be from other vendors. |
| Magnesium chloride, Hexahydrate, molecular biology grade | Calbiochem | 442611 | Can be from other vendors. |
| EDTA | MP Biomedicals | 800682 | Can be from other vendors. |
| Tris, ultra pure, 99.9% pure | MP Biomedicals | 819620 | Can be from other vendors. |
| NP-40 alternative (Nonylphenyl Polyethylene Glycol) | Calbiochem | 492016 | Can be from other vendors. |
| Protease Inhibitors | Sigma | P2714 | this protease inhibitor coctail is a powder. To make 100 x solution dilute in 1 mL of molecular-biology grade water. |
| Magnetic solid phase reverse immobilization beads: AMPure XP beads | Beckman | 63881 | |
| PCR purification kit | HyLabs | EX-GP200 | Can be from other vendors. |
| Nextera DNA Library Preparation Kit (TDE1 transposase and TD buffer) | Illumina | FC-121-1030 | |
| NEBNext High-Fidelity 2 x PCR Master Mix | New England BioLabs | M0541 | |
| NEBNext Q5 Hot Start HiFi PCR Master Mix | New England BioLabs | M0543 | |
| SYBR Green I | Invitrogen | S7585 | |
| CFX Connect Real-Time PCR Detection System | Bio-rad | 185-5200 | Can be from other vendors. |
| CFX Manager Software | Bio-rad | 1845000 | |
| master mix for qPCR: iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-rad | 172-5124 | Can be from other vendors. |
| Qubit fluorometer 2.0 | Invitrogen | Q32866 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen | Q32854 | |
| Magnet for eppendorf tubes | Invitrogen | 12321D | Can be from other vendors. |
| Swing bucket cooling centrifuge with the buckets for 15 mL falcon tubes and eppendorf tubes | Thermo Scientific | 75004527 | Could be from other vendors. It is important that it has buckets for eppendorf tubes. |
| Thermo-shaker | MRC | Can be from other vendors. | |
| High Sensitivity D1000 ScreenTape | Agilent Technologies | 5067-5584 | |
| High Sensitivity D1000 Reagents | Agilent Technologies | 5067-5585 | |
| 4200 TapeStation system | Agilent Technologies | G2991AA | Tape-based platform for electrophoresis |
| High Sensitivity DNA kit | Agilent Technologies | 5067-4626 | Reagent for high-sensitivity TapeStation analysis |
| Primer name and sequence | Company | ||
| Ad1_noMX: 5'-AATGATACGGCGACCACCGAGA TCTACACTCGTCGGCAGCGTC AGATGTG-3' |
IDT | Ad1-noMx: 5'-P5 sequence-transposase sequence-3' | |
| Ad2.1_TAAGGCGA: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG AT[TCGCCTTA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.1_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.2_CGTACTAG: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG AT[CTAGTACG]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.2_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.3_AGGCAGAA: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[TTCTGCCT]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.3_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.4_TCCTGAGC: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG AT[GCTCAGGA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.4_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.5_GGACTCCT: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[AGGAGTCC]GTCTCGTGGG CTCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.5_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.6_TAGGCATG: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[CATGCCTA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.6_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.7_CTCTCTAC: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[GTAGAGAG]GTCTCGTGGG CTCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.7_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.8_CAGAGAGG: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[CCTCTCTG]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.8_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.9_GCTACGCT: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[AGCGTAGC]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.9_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.10_CGAGGCTG: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACG AGAT[CAGCCTCG]GTCTCGTGG GCTCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.10_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.11_AAGAGGCA: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACG AGAT[TGCCTCTT]GTCTCGTGGG CTCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.11_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.12_GTAGAGGA: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACG AGAT[TCCTCTAC]GTCTCGTGGG CTCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.12_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.13_GTCGTGAT: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[ATCACGAC]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.13_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.14_ACCACTGT: 5'- CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[ACAGTGGT]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.14_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.15_TGGATCTG: 5'- CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[CAGATCCA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.15_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.16_CCGTTTGT: 5'- CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[ACAAACGG]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.16_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.17_TGCTGGGT: 5'- CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[ACCCAGCA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.17_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.18_GAGGGGTT: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[AACCCCTC]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.18_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.19_AGGTTGGG: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[CCCAACCT]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.19_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.20_GTGTGGTG: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[CACCACAC]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.20_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.21_TGGGTTTC: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[GAAACCCA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.21_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.22_TGGTCACA: 5'- CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[TGTGACCA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.22_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.23_TTGACCCT: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[AGGGTCAA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.23_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.24_CCACTCCT: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[AGGAGTGG]GTCTCGTGGG CTCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.24_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| F1: 5'-CCTTTTTATTTGCCCATACACTC-3' | IDT | ||
| R1: 5'-CCCAGATAGAAAGTTGGAGAGG-3' | IDT | ||
| F2: 5'-TTGAGGGATGCCATAACAGTC-3' | IDT | ||
| R2: 5'-CTGCTGAACAACATCCTTCAC-3' | IDT | ||
| F3: 5'-GGTTTGCAGGTTGCGTTG-3' | IDT | ||
| R3: 5'-AGAGGAATCTGGGAGTGACG-3' | IDT | ||
| F4: 5'-TGCTCATTCCGTTTCCCTAC-3' | IDT | ||
| R4: 5'-AGCCGGAAAGAAAGTTCCTG-3' | IDT |
References
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