Summary
Assay для Транспозаза-доступные Chromatin, в сочетании с высокой пропускной способностью последовательности (ATAC-seq) является геном общесистемной методом для выявления доступных хроматина. Это шаг за шагом протокол ATAC-seq, от молекулярных окончательного вычислительной анализу, оптимизированный для лимфоцитов человека (Th1/Th2). Этот протокол может быть принят исследователи без предварительного опыта в методах секвенирование нового поколения.
Abstract
Assay для Транспозаза-доступны Chromatin с высокой пропускной способностью последовательности (ATAC-seq) — это метод, используемый для идентификации открытых (доступный) регионов хроматина. Эти регионы представляют регуляторных элементов ДНК (например, промоутеров, усилители, локус контроля регионов, изоляторы), в котором транскрипции факторов привязки. Отображение доступных хроматина пейзаж является мощный подход для выявления активных нормативных элементов по всему геному. Эта информация служит беспристрастный подход для обнаружения сети соответствующих транскрипционных факторов и механизмов структуры хроматина, которые управляют программами выражения гена. ATAC-seq является надежной и чувствительных альтернативой DNase I Гиперчувствительность анализ в сочетании с следующего поколения последовательности (DNase-seq) и при содействии формальдегида изоляции регуляторных элементов (Фэр seq) для анализа генома общесистемной хроматина доступность и последовательность Микрококковая Нуклеаза чувствительных участков (MNase-seq) для определения позиционирования нуклеосома. Мы представляем подробную ATAC-seq протокол, оптимизированный для человека первичной иммунной клетки т.е. CD4 + лимфоцитов (Т-хелперами 1 (Th1) и Th2 клетки). Этот всеобъемлющий протокол начинается с клетки урожая, а затем описывает молекулярное процедура tagmentation хроматина, пробоподготовка для виртуализации нового поколения и также включает методы и соображения для вычислений анализа используется для интерпретировать полученные результаты. Кроме того чтобы сэкономить время и деньги, мы ввели меры контроля качества для оценки ATAC-seq библиотеки до последовательности. Важно отметить, что принципы, изложенные в настоящем Протоколе позволяют его адаптации в другие клетки человека иммунной и неиммунизированных начальных и клеточных линий. Эти руководящие принципы также будут полезны для лабораторий, которые не владеют методами секвенирование нового поколения.
Introduction
ATAC-seq1,2 — надежный метод, который позволяет идентифицировать регулирования3 открытых хроматина регионов и позиционирования нуклеосома. Эта информация применяется для определения местоположения, личность и активности транскрипционных факторов. Чувствительность метода для измерения количественных различий в структуре хроматина позволяет изучение деятельности хроматина факторов, включая хроматина ремонтом и модификаторов, а также транскрипционный анализ деятельности РНК полимеразой II1. Таким образом ATAC-seq обеспечивает мощный и непредвзятого подхода для расшифровки механизмов, которые регулируют регуляцию в любой тип клеток интереса. Мы описываем адаптации ATAC-seq для первичного Th1 и Th2 клетки человека.
В ATAC-seq гиперактивный Tn5 Транспозаза загружен с переходниками для следующего поколения последовательности (НГС) пары фрагментацию ДНК с разметкой ДНК с адаптеров (т.е., процесс «tagmentation»)1. После амплификации PCR в результате библиотеки ДНК готовы для следующего поколения последовательности (рис. 1). Льготные tagmentation доступных хроматина обнаруживается анализ местного обогащения ATAC-seq последовательность читает.
Короткие экспериментальной процедуры и требования для меньше исходного материала, относительно других методов для измерения доступности хроматина и nucleosomal позиционирования DNase-seq4, Фэр seq5и6MNase-seq имеет поощрять использование ATAC-seq в нескольких биологических систем, включая человеческие клетки первичной1,7 и8клинических образцов, а также одноклеточные организмы9,10растений, плодовых мух11 и различных млекопитающих12.
Личность транскрипции, факторы, которые связаны с доступными локусов можно обнаружили анализ обогащения их мотивы последовательности привязки или сочетаются ATAC-seq chromatin иммунопреципитации (чип) следуют высок объём (секвенирование ДНК ChIP-seq). Этот подход позволил идентификации линии специфических транскрипционных факторов важно для кроветворения в мыши13. Беспристрастной и глобальный характер ATAC-seq позволяет изучение гена регулирование в организмов, для которых реагенты, такие как антитела для анализа чипа не доступны. Например, эволюционные изменения в СНГ-регулирования регионах были определены путем изучения черепной нейронные крест клетки человека и шимпанзе14, развития изменения в регуляторных элементов во время ранних мыши Эмбриогенез15, изменения в нормативно-правовой ландшафт во время жизненного цикла одноклеточными C. owzarzaki9и эволюция промоутеров и усилители через 20 млекопитающих видов12.
ATAC-seq также играет важную роль для измерения доступности хроматина в одиночных клетках, таким образом показывая изменчивость в клеточных популяций, который обычно избегает генома общесистемного исследования7,16. Кроме того ATAC-seq может использоваться для изучения изменений, которые происходят в ДНК нормативных областях в условиях заболевания, в которых образцы редки. К примеру, ATAC-seq может использоваться для изучения изменений в нормативно-правовой ландшафт во время наступления острый миелоидный лейкоз (ОМЛ)17 или рас-driven онкогенеза11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
все процедуры были одобрены Советом институциональный обзор Бар-Иланского университета и протокол руководящим комитетом, утверждении экспериментов.
1. очищение от наивного CD4 + клеток человека и поляризации T вспомогательный 1 (Th1) и Th2 клетки
Примечание: здесь мы описываем процедуры, начиная от замороженных периферической крови человека мононуклеарных клеток (получения). Первый шаг состоит из изоляции CD4 + клеток, используя микрошарики и столбцы, обычно дают нам больше, чем 95% CD4 + клеток. Однако этот шаг может варьироваться в зависимости от предпочтительного протокола в каждой лаборатории. Протокол для активации Т-клеток и поляризации был изменен от Дженнера и др. (2009) 18. изоляции CD4 + клеток от 10 миллионов получения дает подняться до 4-6 млн CD4 + клеток. Они разделены на две фляги и вырос под Th1 и Th2 поляризационный условия урожайность 3-5 миллионов Th1 и Th2 клетки в течение всего за неделю.
Примечание: остыть центрифуге до 4 ° C перед началом.
- Размораживание 1 мл человека репликацию (10 7 клеток) в Тюбик 50 мл, содержащие 10 мл среды RPMI, дополненная 1% пенициллина и стрептомицина, 2 мм L-глютамина и 10% тепло инактивированная плода бычьим сывороточным. Центрифуга на 500 g x 5 мин удалить супернатант и Ресуспензируйте клетки с пипеткой стерильные 25 мл 15 мл дополнениями RPMI среды. Передать колбу T75 культуры клетки (с 25 мл стерильной пипеткой).
- Оставить клетки на ночь в увлажненные инкубатора (37 ° C, 5% CO 2).
- Плавающий клетки с 25 мл стерильной пипеткой передать Тюбик 50 мл. Определение количества клеток и жизнеспособности путем исключения Трипановый синий.
- Изолировать CD4 + клеток от 10 миллионов живут не сторонник получения положительных выбор с помощью CD4 + микрошарики и столбцов в зависимости от производителя ' s рекомендации (см. Таблицу материалов/оборудования) со следующим модификации: 10 7 получения помечены с 30 мкл CD4 микрошарики в 120 мкл 0,5% BSA в PBS.
- Активировать CD4 + Т-клеток для 72 h rhIL-2 (10 нг/мл), плита прыгните анти CD3 (5 мкг/мл) и водорастворимые анти CD28 (2 мкг/мл). Th1 поляризации добавьте rhIL-12 (20 нг/мл) и анти Ил-4 (10 мкг/мл). Для Th2 поляризации, добавить rhIL-4 (40 нг/мл) и анти IFN-γ (10 мкг/мл).
- Культура клетки для дополнительные 7 дней при наличии rhIL-2 (10 нг/мл) и же поляризационный цитокинов (rhIL-12 для Th1 и rhIL-4 для Th2).
2. Изоляции ядра
Примечание: ATAC-seq выполняется с нетронутыми ядрами. Содержащий буфера lysis 0,05% nonylphenyl полиэтилен гликоль (см. Таблицу материалы/оборудование) был откалиброван для изоляции ядра от первичного Th1 и Th2 клетки человека. Мы рекомендуем, калибровка этот шаг с лабораторных реагентов и клетки. Избыток нетронутым клеток от недостаточной моющих средств снижает эффективность реакции переноса. Лизис клеток эффективность определяется количество ядер (Трипановый синий позитивные клетки) относительно общего числа клеток.
Примечание: Подготовьте литического буфера (10 мм трис-HCl, pH 7.5, 10 мм NaCl, 3 мм MgCl 2). Остыть центрифуга с ротором свинг ведро до 4 ° C. грануляции клетки в центрифугу свинг ведро вместо центрифуги фиксированный угол уменьшает потери клеток/ядер. Чтобы избежать ядрах или клетки потери, накапайте тщательно когда отбрасывая супернатант.
- Добавить свежие nonylphenyl Полиэтиленгликоль (до конечной концентрации 0,05%) и 100 x ингибиторы протеазы (до конечной концентрации 1 x) для холодной литического буфера непосредственно перед использованием. Сохранить буфер на льду
- Количество Т-клетки для определения их количества и жизнеспособности, с помощью метода Трипановый синий. Жизнеспособность, что меньше, чем 90% результатов в более высоких неспецифических пищеварение.
- Передачи 0,5 x 10 6 T клетки (Th1 или Th2) для 1.5 мл пробирок. Спин вниз на 500 g x 5 мин на 4 ° C.
- Ресуспензируйте Пелле клеток в 1 мл холодного фосфат амортизированное (PBS) физраствора. Спин вниз на 500 g x 5 мин на 4 ° C.
- Ресуспензируйте Пелле клеток в 1 мл холодного литического буфера (содержащие nonylphenyl полиэтиленгликоль и ингибиторы протеазы). Держите трубку на льду. Пипетка осторожно, чтобы избежать нарушения ядер.
- Быстро принять 10 мкл и подсчитать количество ячеек с автоматизированной клеток счетчиком пока Микропробирка с лизированных клетках на льду. Этот шаг не должна превышать пяти минут, чтобы избежать повреждения ядра. По крайней мере 80% клеток должен быть лизированы.
- Продолжить сразу с транспозицией реакции. Держите подготовлен ядер на МКО.
3. Реакции переноса
Примечание: В этот шаг, изолированные ядер инкубируют с эукариотами Tn5 Транспозаза (ТДЕ1) загружен с адаптерами для секвенирования NGS. Гиперактивный Tn5 одновременно фрагменты ДНК и ligates адаптеры в доступных районах генома (процесс tagmentation). Соотношение между ядрами и Tn5 Транспозаза имеет решающее значение для преференциального расщепление на доступных хроматина. Этот протокол откалиброван для 100 000 ядер в 100 мкл реакции тома. Однако, реакция может быть уменьшен.
- Значение температуры в шейкере тепловой до 37 ° C.
- Передачи 100000 ядер до 1,5 мл микропробирок.
- Центрифуг в 500 x g 10 мин при температуре 4 ° C и аккуратно удалить супернатант.
- Добавить компоненты реакции переноса ядер как указано в таблице 1.
- Ресуспензируйте, нежный закупорить.
- Инкубировать транспонирования реакции в шейкере тепловой при 37 ° C за 30 мин с нежно тряска (500 об/мин).
Примечание: Твердофазный реверсивные иммобилизации бисер 19 производится очистка ДНК (см. Таблицу материалы/оборудование) или ПЦР очистки столбцы. В конце очистки элюировать ДНК фрагментов в 20 мкл 10 мм трис-HCl, рН 8. Избегайте ЭДТА в Элюирующий буфер.
4. ПЦР обогащения ATAC-seq библиотек
Примечание: этот шаг призван усилить ATAC-seq библиотеки т.е. фрагментов ДНК с вставленной адаптеры. Чтобы разрешить смешивания нескольких библиотек ATAC-seq в той же последовательности следующего поколения полосы (" мультиплексирования ") неиндексированные использование праймера 1 (Ad1_noMx) 1 для всех образцов, и различные индексированные (со) 2 праймера (Ad 2.1-2.24) 1 для каждого образца. В дополнить Таблицу материалов/оборудования предоставляются последовательностей праймера.
- Амплификации PCR первоначальный
Примечание: Рабочая концентрация праймера 1 (Ad1_noMx) и 2 праймера – 25 мкм. Все праймеры разводят из оригинального запас 100 мкм до 25 мкм. Во всех реакциях PCR использование праймера 1 (Ad1_noMx) и только один из индексированного 2 праймера.- Добавить компоненты реакции PCR как указано в таблице 2 в стерильную ПЦР-пробирку.
- Место ПЦР трубки в тепловая велосипедист и выполнять амплификации PCR используя Велоспорт условий, подробно изложены в таблице 3.
- Оценки числа циклов дополнительного усиления
Примечание: количество дополнительных циклов PCR должна принести достаточное количество библиотеки фрагментов fили успешной виртуализации следующего поколения работать, в то время как свести к минимуму, чтобы избежать GC и размер смещения 20. Определение числа циклов PCR (N), необходимых для оптимального библиотека фрагмент амплификации делается путем количественного PCR (ПЦР).- Развести 1 грунтовки (Ad1_noMx) и 2 (используется для усиления первоначальной библиотеки) от 25 мкм до 6,25 мкм.
- Добавить компоненты оптические трубы ПЦР или тарелку, как указано в таблице 4.
- Место в инструмент ПЦР и цикл как указано в таблице 5.
- Оценить требуемое количество дополнительного усиления циклов (N), участок номер цикла на оси x и относительной флуоресцирования (РФС) на оси y.
- Количество дополнительного усиления циклов (N)-1/3 от числа циклов, в которых реакции ПЦР достигли плато. на рисунке 2 приведены примеры для трех ATAC-seq библиотек, которые достигли плато на ~ 2350 единиц относительной флуоресценции, РФС (густой зеленой линии). Число циклов PCR, в которых усиливается одну треть от суммы максимальной (783 РФС, отмеченные на оси y) соответствует 8 циклов для двух библиотек (красный и синий амплификации кривых) и 9 циклов PCR для третьего библиотеки (розовый).
- Окончательный ПЦР-амплификации
- усиливают оставшиеся 45 мкл реакции PCR. Место ПЦР-пробирки, содержащие усиление реакции от шага 4.1.2 в тепловая велосипедист. Запустите программу PCR, описанные в таблице 6. Используйте ранее определенных (шаг 4.2.5) количество циклов амплификации (N).
5. Размер выбор ATAC-Seq библиотек
Примечание: наш опыт показывает, выбор размера усиливается ATAC-seq библиотек улучшает результаты секвенирование нового поколения, потому что он устраняет высокомолекулярного библиотеки фрагментов из Окончательный библиотека ATAC-seq.
Примечание: Разрешить магнитные шарики в теплой комнатной температуре 30 мин перед использованием.
Подготовьте свежие 70% этанола в свободной от нуклеиназы воды.
- Ресуспензируйте магнитные бусы, смешивая.
- Добавить нуклеиназы свободной воды на ATAC-seq библиотеки (полученные на шаге 4.3.1.) и довести до 100 мкл.
- Добавьте 50 мкл (0.5 x) ресуспензированы ДНК связывающих магнитные шарики до 100 мкл усиливается библиотек. Смешайте закупорить вверх и вниз по крайней мере 10 раз. Проинкубируйте образцы для 5 мин при комнатной температуре. При необходимости, быстро вращаться вниз микропробирок.
- Место трубки на соответствующие магнитного стенд за 2 мин отделить магнитные шарики от супернатант. Через 2 мин, супернатанта передать новый Микропробирка.
- Измерить объем супернатанта, закупорить и добавить 0.7 x магнитных шариков. Микс, закупорить вверх и вниз по крайней мере 10 раз.
- Инкубировать 5 мин при комнатной температуре. Место на магнитного стенд на 2 мин
- После 2 минут инкубации, удалить супернатант. Добавить 200 мкл свежеприготовленные 70% этанол мыть бисер, пока трубы на магнитную подставку.
- Держите Микропробирка на магните для 30 s и затем отмены этанола. Повторите шаг 5.7.for два окончательный этанола смывки.
- Полностью удалить оставшиеся этанола и пусть бусы воздушно-сухой для 5 минут пока трубку на магните. При необходимости, кратко спина микропробирок. Удаление следов этанола с кончиком пипетки p10.
- Удаление Микропробирка из магнита и 22 мкл 10 мм трис-HCl, рН 8. Не элюировать ATAC-seq библиотек в буфер, содержащий ЭДТА.
- Инкубировать трубки для 2 мин при комнатной температуре, а затем поместить на магнитную подставку.
- Когда решение ясно, передать новым стерильным Микропробирка 20 мкл eluted библиотек.
- Магазин размер выбранных ATAC-seq библиотек в -20 ° с.
6. Анализ качества ATAC-Seq библиотек
- проверки качества ATAC-seq библиотек в реальном масштабе времени PCR
Примечание: важно оценить соотношение сигнал-шум ATAC-seq библиотек до следующего поколения последовательности. Это делается путем определения относительного количества фрагментов ДНК из доступных и недоступных локусов, с использованием количественного PCR (ПЦР). Недоступных локусов (отрицательный контроль, chr1:48, 137, 860-48,137,934 и chr1:193, 093, 748-193,093,827) усиливается пары праймера 1 и 2. Доступных локусов (положительный контроль, chr19:30, 336, 166-30,336,253 и chr19:11546154-11546237) усиливается грунтовка пар 3 и 4. Позитивные и негативные локусов были определены от хроматина доступности (DHS-seq) профили CD4 + клеток человека (ENCODE присоединения ENCSR000EQE и ENCSR000EQG). Отрицательный грунтовка 1 расположен в большой гетерохроматиновые intergenic регионе (230 kb из TRADB2 и 88 КБ от FOXD2). Отрицательный контроль регион 2 находится в в первый Интрон гена CDC73. Положительное, что грунт пара 3 находится в пределах региона открытым хроматина течению циклин E (CCNE1) гена при положительных грунтовка пара 4 располагается в промоутер протеин киназы C субстрата 80 K-H (PRKCSH). Важно отметить, что эти управления локусов показывают аналогичная картина доступности в других типах клеток человека от проекта ENCODE 3, предполагая, что они могут применяться для мониторинга ATAC-seq библиотек от широкого спектра типов клеток человека. Грунтовка эффективность и специфику всех пар грунт был подтверждена ПЦР на серийный разрежения геномной ДНК (от клеток человека Th) и плавления кривой анализ получаемой продукции усиливается.- Изолировать геномной ДНК, использование коммерчески доступных комплект (см. Таблицу материалов/оборудования).
- Развести усиливается ATAC-seq библиотеки 1:10 (1 мкл библиотека + 9 мкл нуклеиназы свободной воды) и ~ 5 нг/мкл геномной ДНК.
- Подготовить реакционную смесь (Таблица 7) для каждой пары праймера положительной и отрицательной контроля, принимая во внимание, что реакции выполняются в трех экземплярах.
- Инкубировать в ПЦР тепловая велосипедист согласно протоколу, рекомендованный поставщик мастер смесь ПЦР.
- Анализ результатов ПЦР инструмент ' s программного обеспечения (см. Таблицу материалов/оборудования). Выберите геномной ДНК как образец элемента управления. Полученные значения представляют собой обогащение доступных областей (усиленный, положительный контроль грунты). Пример приведен в таблице 8.
Примечание: Оценки среднего библиотека размера и концентрации: распределение размера фрагментов ДНК из библиотек ATAC-seq определяется автоматизированной электрофореза высок чувствительности систем согласно данным производителя ' s инструкции. Это целесообразно для измерения концентрации образца на флюорометр с помощью комплекта dsDNA высок чувствительности и по крайней мере 2 мкл каждого образца ДНК.
Примечание: Секвенирование нового поколения - до мультиплексирования библиотек, рассчитать Молярность каждой ATAC-seq библиотеки с использованием формулы: (6 нг/мкл x 10) / (660 x средняя библиотека фрагмент длиной). Цель для > 30 миллионов читает каждой библиотеки ATAC-seq для оценки открытых хроматину регионами образцах. Если вы хотите определить, если библиотека является достаточно хорошим для секвенирования NGS, первоначально цель чтений (5% от последовательности Лейн на инструменте секвенирования ДНК в режиме быстрого выполнения) ~ 10 млн. Имейте в виду, что для выведения нуклеосома позиционирования, в паре конец последовательности необходимых 1.
7. Анализ полученных результатов секвенирования следующего поколения
- вывести качество чтения последовательности, проверяя файлы FastQC, отдельно для каждой библиотеки.
- Выравнивание читает генома человека ссылка (сборка hg19) с помощью Боути 21 программного обеспечения в среде Unix/Linux. Команда ' Боути -m 1 - q -S генома каталог reads.fastq output_aligned.sam '. Геном каталог стоит для папки, где хранятся индексы генома Bowtie. Параметр -m 1 предназначен для не позволяя выравнивание читает для более чем одного локуса в геноме, - q для входного файла, который должен быть в формате fastq, -S для вывода в формате SAM.
- Удалить дубликаты считывает параметр SAMtools 22 rmdup в среде Unix/Linux. Команды являются ' samtools посмотреть -S output_aligned.sam -b | SAMtools сортировка -o-output_aligned > output_aligned.bam ',
samtools rmdup -s output_aligned.bam output_aligned _rmdup.bam '. Первая команда, вид, изменяет формат Сэм в БАМЕ формат, который затем сортируется. Параметр rmdup применяется на файле отсортированных BAM. При необходимости можно регулировать читает для вставки сайт transposon, как описано в оригинальной ATAC-seq документ 1. Это делается с помощью BEDtools команды 23 в среде Unix/Linux. Команды являются ' bamToBed -i output_aligned _rmdup.bam > output_aligned _rmdup.bed ', ' shiftBed -i геном 4 - м-5 - g -p _rmdup.bed output_aligned > output_aligned _rmdup_adjusted.bed '. Первая команда, bamTobed, изменяет формат BAM в постели формат, который может затем использоваться для команды shiftBed. Геном файл является файлом с разделителями табуляции, содержащий длину каждой хромосомы в геноме. Обычно добавляется файл в папке BEDtools. - Выполнять пик вызова с помощью анализа на основе модели чип seq (MACS2) 24 программного обеспечения в среде Unix/Linux на сдвинутые кровати файл со следующими параметрами:--nomodel--extsize 75--сдвиг -30. Эти параметры используются для настройки операций чтения, таким образом, чтобы вставки сайт transposon в середине каждой последовательности чтения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Окончательный результат этого протокола является библиотека ATAC-seq обычно 3-20 нг/мкл. При запуске в системе для анализа целостности ДНК (см. Таблицу материалов/оборудования), они показывают внешний вид лестницы как2 (рис. 3A). Средний размер фрагментов ДНК обычно составляет ~ 450-530 bp.
Надлежащий контроль качества ATAC-seq библиотек до выполнения следующего поколения последовательности важно сэкономить время и деньги. Мы считаем библиотек для следующего поколения последовательности (НГС), когда обогащению позитивных элементов более чем 25 - и 75 раз (для грунтовки пар 3 и 4, соответственно) по сравнению с негативный контроль (рис. 3B) и когда они показывают внешний вид nucleosomal, лестница как уже упоминалось ранее. При анализе данных ПЦР, мы также проверяем что Cq значения для грунтовки отрицательных и положительных управления схожи в реакциях с геномной ДНК как шаблон и что ов значений для отрицательного контроля регионов (в реакциях с ATAC-seq ДНК фрагменты) являются постоянными между экспериментов. Например в случае неожиданно Нижняя Cq ценностей, мы подозреваем, что ядра были чрезмерно транспонированных и таким образом фрагментов ДНК, возникая от гетерохроматин регионы перепредставлены. Кроме того если гель образ (получен электрофорезом на основе ленты высокой чувствительности) ATAC-seq библиотек указывает на присутствие адаптеров (~ 120 bp), чрезмерной деградации ДНК (большинство фрагментов являются ~ 200 bp), или большие фрагменты (более 1 КБ), мы впредь не будет шаг NGS.
Кроме того мы всегда выполнять первоначальные NGS, в котором мы стремимся для 10 миллионов считывает за библиотеки. Если результаты этой последовательности являются удовлетворительными (образец проходит все параметры в файле отчета FastQC и мы можем получить 1000-2000 вершины после выполнения вызова пик), более глубоко виртуализируются библиотеки (более 30 миллионов читает/ATAC-seq библиотека).
В ATAC-seq экспериментов на клетки млекопитающих, везде от ~ 30-70% операций последовательного чтения может исходить от мтДНК10. В противоположность этому наши библиотеки содержится 6-20% читает сопоставляется митохондриального генома. Это ниже, чем сообщалось 46% в библиотеке ATAC-seq от человека лимфоцитов CD4 + T1. После устранения этих загрязняющих читает, мы остались с ~ 7-32 миллиона уникальных читает картирования генома человека ссылка (58% - 91% всех операций чтения). От них, 0.1 - 2 миллиона читает (6,8% - 12% всех прочтений) были в ATAC-seq пиков (рис. 4).
Рисунок 1 . Рабочий процесс экспериментальной шагов. Представление основных шагов в этом протоколе ATAC-seq. Остановка точки обозначаются желтым шестиугольников. Необязательный шаг представляет собой оранжевый шестиугольника. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 . Расчет дополнительного числа циклов PCR, необходимых для окончательного обогащения библиотек ATAC-seq. Кривые амплификации PCR для трех различных библиотек seq ATAC приведены в красный, синий и розовый. Реакции амплификации достигли плато в 2350 РФС (верхняя Зеленая горизонтальная линия). Количество дополнительных циклов PCR пересекается с 783 РФС (2350/3) на кривой амплификации. Две библиотеки (красный и синий) требуют 8 дополнительного усиления циклов, в то время как третий библиотека (розовый) требует 9 циклов. Non шаблона элемента управления (NTC) отображается как нижней зеленой линии. Оси x, номер цикла. Ось y, РФС единиц. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 . Анализ качества контроля библиотек ATAC-seq. (A) результаты ленты на основе автоматизированных электрофореза усиливается ATAC-seq библиотек. L, лестница; A-D, библиотеки биологических повторяется от Th1 и Th2 клетки. (B) ПЦР анализ контроля качества ATAC-seq библиотек. Геномная ДНК и четыре библиотеки ATAC-seq усугубляются отрицательный контроль грунтовка пар (1 и 2) и положительный контроль грунтовки (3 и 4). Полученные значения для ATAC-seq библиотек (синий) впервые были нормализованы к амплификации уровнях геномной ДНК (произвольно присвоено значение 1; красный). Впоследствии значения для позитивного управления регионов были нормализованы в отрицательный контроль регионы (Нижняя диаграмма). NGS последовательности были разосланы библиотеки #1 и #2. Значения представляют собой среднее ± SEM. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4 . Генома браузер snapsh ots доступных хроматина регионов в клетках Th1 и Th2. ATAC-seq треки отображаются для NFKB1, JUN, CD28, IFNG (выражается только в Th1) и IL4 и IL13 (выражается только в Th2) локусов в Th1 и Th2 клетки (два биологических повторяется для каждого). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| ТД буфер | 50 | МКЛ |
| Транспозаза ТДЕ1 | 5 | МКЛ |
| Нуклеаза свободной воды | 45 | МКЛ |
| Общий объем | 100 | МКЛ |
Таблица 1: Приготовление смеси реакции транспонирования.
| ATAC-seq Библиотека | 15 | МКЛ |
| Грунтовка 1 (Ad1_noMx) * | 2.5 | МКЛ |
Таблица 2: Компоненты начальной смеси реакции PCR (шаг 5.1.1.).
| ШАГ ЦИКЛА | ТЕМПЕРАТУРА | ВРЕМЯ | ЦИКЛЫ |
| Расширение * | 72 ° C | 5 мин | 1 |
| Первоначальный денатурации | 98 ° C | 30 s | |
| Денатурация | 98 ° C | 10 s | 5 |
| Отжиг | 63 ° C | 30 s | |
| Расширение | 72 ° C | 3 мин | |
| Удерживайте | 4 ° C | ∞ | |
| * Этот шаг необходим для расширения оба | |||
| концах праймеров после транспонирования реакции. | |||
Таблица 3: Условия PCR Велоспорт для первоначальной библиотеки амплификации (шаг 5.1.2.)
| Аликвота реакции PCR (шаг 4.1.1) * | 5 | МКЛ |
| Грунтовка 1 (Ad1_noMx) ** | 1 | МКЛ |
| Грунтовка 2 | 1 | МКЛ |
| 2 x SYBR мастер смесь *** | 7.5 | МКЛ |
| Нуклеаза свободной воды | 0.5 | МКЛ |
| Общий объем | 15 | МКЛ |
| * Для non шаблона элемента управления вместо шаблона дна добавьте ультра-чистой воды. | ||
| Конечная концентрация каждого праймера – 417 Нм. | ||
| Используйте предпочтительный мастер смесь для ПЦР. | ||
| Он должен содержать, полимеразу, дНТФ, MgCl2и флуоресцентные краски. | ||
Таблица 4: Подготовка ПЦР реакционной смеси (шаг 5.2.2).
| ШАГ ЦИКЛА | ТЕМПЕРАТУРА | ВРЕМЯ | ЦИКЛЫ |
| Первоначальный денатурации | 98 ° C | 30 s | 1 |
| Денатурация | 98 ° C | 10 s | 20 |
| Отжиг | 63 ° C | 30 s | |
| Расширение | 72 ° C | 3 мин | |
| Удерживайте | 4 ° C | ∞ |
Таблица 5: Велоспорт условий для оценки на основе ПЦР дополнительного числа циклов амплификации (N) (шаг 5.2.3.)
| ШАГ ЦИКЛА | ТЕМПЕРАТУРА | ВРЕМЯ | ЦИКЛЫ |
| Первоначальный денатурации | 98 ° C | 30 s | 1 |
| Денатурация | 98 ° C | 10 s | N |
| Отжиг | 63 ° C | 30 s | |
| Расширение | 72 ° C | 3 мин | |
| Удерживайте | 4 ° C | ∞ |
Таблица 6: Велоспорт условия для окончательного ПЦР обогащения шаг (шаг 5.3.).
| Для одного реакции PCR: | ||
| Разбавление библиотеки геномной ДНК | 2.5 | МКЛ |
| 10 мкм праймера F (F1 или F2 или F3 или F4) * | 0,3 | МКЛ |
| 10 мкм грунтовка R (R1 или R2 и R3 и R4) ** | 0,3 | МКЛ |
| 2 x SYBR мастер смесь *** | 5 | МКЛ |
| Нуклеаза свободной воды | 1.9 | МКЛ |
| Общий объем | 10 | МКЛ |
| Окончательного содержания каждого праймера в реакционной смеси-300 Нм. | ||
| ** Если используется грунтовка F1, чем R грунт должен быть R1 и т.д. | ||
| Использование предпочтение 2 x мастер смесь для ПЦР инструмент в вашей лаборатории. | ||
Таблица 7: Условия реакции для анализа КК (шаг 7.1.3.).
| Цель | Пример | Значит, Cq | CQ SEM | Относительное количество | Нормированный | |
| 1 | Отрицательный контроль | ATAC-seq | 30.39 | 0,11 | 1 | 1.01 |
| Геномная ДНК | 30,4 | 0.16 | 0.99 | 1 | ||
| 2 | ATAC-seq | 30.3 | 0,18 | 1 | 1 | |
| Геномная ДНК | 30,34 | 0,09 | 0.99 | 1 | ||
| 3 | Положительный контроль | ATAC-seq | 23.27 | 0,03 | 1 | 173.14 |
| Геномная ДНК | 30,7 | 0,06 | 0.01 | 1 | ||
| 4 | ATAC-seq | 21.55 | 0,24 | 1 | 750.31 | |
Таблица 8: Расчет обогащения положительный контроль за негативный контроль (шаг 7.1.5.).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ATAC-seq протокол, описанный здесь успешно применяются для анализа доступных хроматина в Главные ячейки (человека Th1, Th2 клетки и клетки B) а также искусственный клеточных линий (MCF10A молочной железы человека раковые клетки и клетки U261 глиобластома). Применение ATAC-seq в другие типы клеток, может потребовать некоторых оптимизации протокола, особенно в лизис шаг. При слишком высокой концентрации неионогенных моющего средства, возможно, более высокий процент загрязнения митохондриальной ДНК. Это может быть сокращен путем уменьшения стиральный порошок концентрация литического буфера без снижения урожайности ядер. По нашему опыту литического буфера с 0,05% моющего средства дал наиболее удовлетворительных результатов. Кроме того спиннинг ядер в свинг ведро вместо фиксированный угол ротора, позволило снизить силу G к 500, что снижение митохондрий в гранулы. Исследователи могут также проверить другие типы моющих средств, например, digitonin17. Однако даже с оптимизированной лизис условий, мтДНК загрязнение является неизбежным. Чтобы полностью удалить мтДНК, ТРИФОСФАТЫ/Cas9 система может быть использоваться15. В этом случае ATAC-seq библиотеки инкубируют с sgRNAs целевой мтДНК и Cas9 Нуклеаза переваривать мтДНК15.
Количество ядер, необходимые для этого ATAC-seq протокола (100,000) может ограничить в тех случаях, когда число клеток от клинических образцов дефицитных7. ATAC-seq был успешно увеличен до 5000 и 500 клеток в1,13,17 путем сокращения реакции том1,13, очистки с магнитной бусины вместо с колоннами 13, или избегать очистки шаг1. Кроме того одноклеточных ATAC-seq (scATAC-seq) может выполняться с использованием microfluidic устройства для разделения отдельных ядер16. В частности другие методы для измерения доступности хроматина, например DNase-seq и Фэр seq, требуют больше исходного материала и несколько дней для выполнения эксперимента.
Теперь широко оценили, что перекосы в различных методов NGS являются общие явления25. Одной из причин вариации в разных хроматина доступность мер является ферментативного расщепления шаг25. Было показано, что DNase I показано расщепления смещения26 и теперь признается, что Tn5 Транспозаза показывает предпочтение расщепление также27. К счастью потенциальные смещения может быть идентифицирован вычислений с помощью конвейера контроля качества как Чилин28. Другим распространенным источником предвзятости является PCR амплификация шаг20,25. Это часто проявляется как уклон для амплификации ГК богатыми фрагменты25. Так как смещение увеличивается с каждым шагом амплификации PCR, мы не превышает 9 дополнительных циклов (N) в окончательном амплификации PCR ATAC-seq библиотек.
Правильное соотношение между Tn5 Транспозаза и ядер имеет решающее значение для успешного ATAC-seq2. Избыток фермента приведет к «над транспонирования» в недоступных локусов и высокий фон. Это выражается в высокой амплификации регионов отрицательный контроль на этапе контроля качества ПЦР. Избыток ядер приведет к «заместитель транспонирования». В этом случае слишком далекой расщепления сайтов приведет к меньше ПЦР усиливается фрагменты и низкой библиотека сложности. Чтобы точно определить количество ядер, мы ввели дополнительный шаг подсчета после лизиса клеток и до реакции переноса.
Хроматина доступность является важным эпигеномный нормативные слой как он разрешает деятельность транскрипции регуляторов в определенных местах, геномных. Таким образом последовательность ДНК в пределах доступной хроматина профиль обеспечивает большой объем информации о личности и цели локусов десятков возможных транскрипционных факторов. Сочетание Эта полученная (ATAC-seq) с профилем РНК выражение позволяет сосредоточиться на соответствующих транскрипции факторов, которые могут быть далее проанализированы чип seq13,22. Кроме того только 10% полиморфизмы связанные заболевания находятся в кодирования генома30. Таким образом применение ATAC-seq для клинических образцов можно выявить, какой из вариантов некодирующих находятся на нормативных элементов, которые могут повлиять на регулирование гена в состоянии болезни (например, красная волчанка8). Мы надеемся, что этот протокол ATAC-seq будет помогать и поощрять заинтересованные следователи использовать этот мощный метод для продвижения их исследования.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Эта работа поддерживается Фондом науки Израиля (Грант 748/14), Мари Кюри интеграции Грант (CIG) - FP7-люди-20013-сиг-618763 и -CORE программа планирования и составления бюджета Комитет и фонд науки Израиль Грант № 41/11.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50 mL tubes | Lumitron | LUM-CFT011500-P | Can be from other vendors. |
| Microtubes | Axygen Inc | MCT-175-C | Can be from other vendors. |
| 25 mL serological pipettes | Corning Costar | 4489 | Can be from other vendors. |
| Tissue culture flask | Lumitron | LUM-TCF-012-250-P | Can be from other vendors. |
| Countes Automated Cell Counter | Invitrogen | C10227 | |
| NucleoSpin Tissue | MACHEREY-NAGEL | 740952.5 | |
| Peripheral blood mononuclear cells (PBMC) | ATCC | PCS800011 | Can be from other vendors. |
| RPMI 1640 Medium | Biological Industries | 01-103-1A | Can be from other vendors. |
| L-Glutamine Solution (200 mM) | Biological Industries | 03-020-1B | Can be from other vendors. |
| Penicillin-Streptomycin | Biological Industries | 03-031-1B | Can be from other vendors. |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated, European Grade | Biological Industries | 04-127-1 | Can be from other vendors. |
| MACS CD4 microbeads, human | Miltenyi Biotec | 130-045-101 | |
| MACS MS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Anti-Human CD4 FITC | Biogems | 06121-50 | |
| Mouse IgG1 Isotype Control FITC | Biogems | 44212-50 | |
| Anti-Human CD3 (OKT3) | Tonbo biosciences | 40-0037 | |
| Anti-Human CD28 SAFIRE Purified | Biogems | 10311-25 | |
| Recombinant Human IL2 | Peprotech | 200-02 | |
| Recombinant Human IL4 | Peprotech | 200-04 | |
| Recombinant Human IL12 p70 | Peprotech | 200-12 | |
| In Vivo Ready Anti-Human IL-4 (MP4-25D2) | Tonbo | 40-7048 | |
| LEAF Purified anti-human IFN-γ | BioLegend | 506513 | |
| NaCl, analytical grade | Carlo Erba | 479687 | Can be from other vendors. |
| Magnesium chloride, Hexahydrate, molecular biology grade | Calbiochem | 442611 | Can be from other vendors. |
| EDTA | MP Biomedicals | 800682 | Can be from other vendors. |
| Tris, ultra pure, 99.9% pure | MP Biomedicals | 819620 | Can be from other vendors. |
| NP-40 alternative (Nonylphenyl Polyethylene Glycol) | Calbiochem | 492016 | Can be from other vendors. |
| Protease Inhibitors | Sigma | P2714 | this protease inhibitor coctail is a powder. To make 100 x solution dilute in 1 mL of molecular-biology grade water. |
| Magnetic solid phase reverse immobilization beads: AMPure XP beads | Beckman | 63881 | |
| PCR purification kit | HyLabs | EX-GP200 | Can be from other vendors. |
| Nextera DNA Library Preparation Kit (TDE1 transposase and TD buffer) | Illumina | FC-121-1030 | |
| NEBNext High-Fidelity 2 x PCR Master Mix | New England BioLabs | M0541 | |
| NEBNext Q5 Hot Start HiFi PCR Master Mix | New England BioLabs | M0543 | |
| SYBR Green I | Invitrogen | S7585 | |
| CFX Connect Real-Time PCR Detection System | Bio-rad | 185-5200 | Can be from other vendors. |
| CFX Manager Software | Bio-rad | 1845000 | |
| master mix for qPCR: iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-rad | 172-5124 | Can be from other vendors. |
| Qubit fluorometer 2.0 | Invitrogen | Q32866 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen | Q32854 | |
| Magnet for eppendorf tubes | Invitrogen | 12321D | Can be from other vendors. |
| Swing bucket cooling centrifuge with the buckets for 15 mL falcon tubes and eppendorf tubes | Thermo Scientific | 75004527 | Could be from other vendors. It is important that it has buckets for eppendorf tubes. |
| Thermo-shaker | MRC | Can be from other vendors. | |
| High Sensitivity D1000 ScreenTape | Agilent Technologies | 5067-5584 | |
| High Sensitivity D1000 Reagents | Agilent Technologies | 5067-5585 | |
| 4200 TapeStation system | Agilent Technologies | G2991AA | Tape-based platform for electrophoresis |
| High Sensitivity DNA kit | Agilent Technologies | 5067-4626 | Reagent for high-sensitivity TapeStation analysis |
| Primer name and sequence | Company | ||
| Ad1_noMX: 5'-AATGATACGGCGACCACCGAGA TCTACACTCGTCGGCAGCGTC AGATGTG-3' |
IDT | Ad1-noMx: 5'-P5 sequence-transposase sequence-3' | |
| Ad2.1_TAAGGCGA: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG AT[TCGCCTTA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.1_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.2_CGTACTAG: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG AT[CTAGTACG]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.2_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.3_AGGCAGAA: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[TTCTGCCT]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.3_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.4_TCCTGAGC: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG AT[GCTCAGGA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.4_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.5_GGACTCCT: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[AGGAGTCC]GTCTCGTGGG CTCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.5_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.6_TAGGCATG: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[CATGCCTA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.6_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.7_CTCTCTAC: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[GTAGAGAG]GTCTCGTGGG CTCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.7_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.8_CAGAGAGG: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[CCTCTCTG]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.8_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.9_GCTACGCT: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[AGCGTAGC]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.9_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.10_CGAGGCTG: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACG AGAT[CAGCCTCG]GTCTCGTGG GCTCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.10_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.11_AAGAGGCA: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACG AGAT[TGCCTCTT]GTCTCGTGGG CTCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.11_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.12_GTAGAGGA: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACG AGAT[TCCTCTAC]GTCTCGTGGG CTCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.12_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.13_GTCGTGAT: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[ATCACGAC]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.13_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.14_ACCACTGT: 5'- CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[ACAGTGGT]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.14_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.15_TGGATCTG: 5'- CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[CAGATCCA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.15_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.16_CCGTTTGT: 5'- CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[ACAAACGG]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.16_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.17_TGCTGGGT: 5'- CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[ACCCAGCA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.17_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.18_GAGGGGTT: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[AACCCCTC]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.18_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.19_AGGTTGGG: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[CCCAACCT]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.19_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.20_GTGTGGTG: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[CACCACAC]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.20_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.21_TGGGTTTC: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[GAAACCCA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.21_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.22_TGGTCACA: 5'- CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[TGTGACCA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.22_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.23_TTGACCCT: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[AGGGTCAA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.23_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| Ad2.24_CCACTCCT: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[AGGAGTGG]GTCTCGTGGG CTCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.24_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
| F1: 5'-CCTTTTTATTTGCCCATACACTC-3' | IDT | ||
| R1: 5'-CCCAGATAGAAAGTTGGAGAGG-3' | IDT | ||
| F2: 5'-TTGAGGGATGCCATAACAGTC-3' | IDT | ||
| R2: 5'-CTGCTGAACAACATCCTTCAC-3' | IDT | ||
| F3: 5'-GGTTTGCAGGTTGCGTTG-3' | IDT | ||
| R3: 5'-AGAGGAATCTGGGAGTGACG-3' | IDT | ||
| F4: 5'-TGCTCATTCCGTTTCCCTAC-3' | IDT | ||
| R4: 5'-AGCCGGAAAGAAAGTTCCTG-3' | IDT |
References
- Buenrostro, J. D., Giresi, P. G., Zaba, L. C., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position. Nat Methods. 10 (12), 1213-1218 (2013).
- Buenrostro, J. D., Wu, B., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. ATAC-seq: A method for assaying chromatin accessibility genome-wide. Curr Protoc Mol Biol. , 21.29.1-21.29.9 (2015).
- Thurman, R. E., Rynes, E., et al. The accessible chromatin landscape of the human genome. Nature. 489 (7414), 75-82 (2012).
- Song, L., Crawford, G. E. DNase-seq: a high-resolution technique for mapping active gene regulatory elements across the genome from mammalian cells. Cold Spring Harb Protoc. (2), (2010).
- Simon, J. M., Giresi, P. G., Davis, I. J., Lieb, J. D. Using formaldehyde-assisted isolation of regulatory elements (FAIRE) to isolate active regulatory DNA. Nat Protoc. 7 (2), 256-267 (2012).
- Cui, K., Zhao, K. Genome-Wide Approaches to Determining Nucleosome Occupancy in Metazoans Using MNase-Seq. Methods Mol Biol. 833, 413-419 (2012).
- Qu, K., et al. Individuality and Variation of Personal Regulomes in Primary Human T Cells. Cell Syst. 1 (1), 51-61 (2015).
- Scharer, C. D., et al. ATAC-seq on biobanked specimens defines a unique chromatin accessibility structure in naïve SLE B cells. Sci Rep. 6, 27030 (2016).
- Sebé-Pedrós, A., et al. The Dynamic Regulatory Genome of Capsaspora and the Origin of Animal Multicellularity. Cell. 165 (5), 1224-1237 (2016).
- Lu, Z., Hofmeister, B. T., Vollmers, C., DuBois, R. M., Schmitz, R. J. Combining ATAC-seq with nuclei sorting for discovery of cis-regulatory regions in plant genomes. Nucleic Acids Res. 45 (6), e41 (2016).
- Davie, K., et al. Discovery of Transcription Factors and Regulatory Regions Driving In Vivo Tumor Development by ATAC-seq and FAIRE-seq Open Chromatin Profiling. PLOS Genet. 11 (2), (2015).
- Villar, D., et al. Enhancer Evolution across 20 Mammalian Species. Cell. 160 (3), 554-566 (2015).
- Lara-Astiaso, D., et al. Chromatin state dynamics during blood formation. Science. 345 (6199), 943-949 (2014).
- Prescott, S. L., et al. Enhancer Divergence and cis-Regulatory Evolution in the Human and Chimp Neural Crest. Cell. 163 (1), 68-83 (2015).
- Wu, J., et al. The landscape of accessible chromatin in mammalian preimplantation embryos. Nature. 534 (7609), 652-657 (2016).
- Buenrostro, J. D., et al. Single-cell chromatin accessibility reveals principles of regulatory variation. Nature. 523 (7561), 486-490 (2015).
- Corces, M. R., et al. Lineage-specific and single-cell chromatin accessibility charts human hematopoiesis and leukemia evolution. Nat Genet. 48 (10), 1193-1203 (2016).
- Jenner, R. G., et al. The transcription factors T-bet and GATA-3 control alternative pathways of T-cell differentiation through a shared set of target genes. Proc Natl Acad Sci USA. 106 (42), 17876-17881 (2009).
- DeAngelis, M. M., Wang, D. G., Hawkins, T. L. Solid-phase reversible immobilization for the isolation of PCR products. Nucleic Acids Res. 23 (22), 4742-4743 (1995).
- Aird, D., et al. Analyzing and minimizing PCR amplification bias in Illumina sequencing libraries. Genome Biol. 12 (2), R18 (2011).
- Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biol. 10 (3), R25 (2009).
- Li, H., Handsaker, B., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).
- Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).
- Zhang, Y., et al. Model-based Analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biol. 9 (9), R137 (2008).
- Meyer, C. A., Shirley Liu, X. Identifying and mitigating bias in next-generation sequencing methods for chromatin biology. Nat Rev Genet. 15 (11), 709-721 (2014).
- He, H. H., et al. Refined DNase-seq protocol and data analysis reveals intrinsic bias in transcription factor footprint identification. Nat Methods. 11 (1), 73-78 (2013).
- Madrigal, P. On Accounting for Sequence-Specific Bias in Genome-Wide Chromatin Accessibility Experiments: Recent Advances and Contradictions. Front Bioeng Biotechnol. 3, 1-4 (2015).
- Qin, Q., et al. ChiLin: a comprehensive ChIP-seq and DNase-seq quality control and analysis pipeline. BMC Bioinformatics. 17 (1), (2016).
- Bao, X., et al. A novel ATAC-seq approach reveals lineage-specific reinforcement of the open chromatin landscape via cooperation between BAF and p63. Genome Biol. 16 (1), 284 (2015).
- Maurano, M. T., et al. Systematic localization of common disease-associated variation in regulatory DNA. Science. 337 (6099), 1190-1195 (2012).
