Практические соображения в изучении метастатического легких колонизации в остеосаркома, используя Assay легочных метастазов
Summary
Цель этой статьи заключается в том, предоставить подробное описание протокола для assay легочных метастазов (PuMA). Эта модель позволяет исследователям изучить метастатического остеосаркома (OS) рост клеток в легочной ткани, с помощью widefield флуоресценции или конфокальный лазерный сканирующий микроскоп.
Abstract
Assay легочных метастазов (PuMA) — ex vivo экспланта легких и закрытыми порами культуры система, которая позволяет исследователям для изучения биологии легких колонизации в остеосаркома (ОС) по микроскопии флуоресцирования. Эта статья содержит подробное описание протокола и рассматриваются примеры получения данных изображения на метастатическим роста, с помощью widefield или конфокальный флуоресценции микроскопии платформ. Гибкость Пума модели позволяет исследователям изучить не только рост клеток ОС в легких микроокружения, но и оценить эффекты анти метастатическим терапии с течением времени. Конфокальная микроскопия позволяет беспрецедентным, с высоким разрешением изображений ОС взаимодействия клеток с паренхимы легких. Кроме того когда модель PuMA сочетается с флуоресцентными красителями или генетические Репортеры флуоресцентный белок, исследователи могут изучить легких микроокружения, клеточном и субклеточном структур, функции гена и промоутер деятельность в метастатических OS клеток. PuMA модель обеспечивает новый инструмент для остеосаркомы исследователей для обнаружения новых метастаз биологии и оценить деятельность роман с метастазами, целенаправленной терапии.
Introduction
Улучшения результатов для педиатрических больных с метастатическим остеосаркома (ОС) по-прежнему остается критическим неудовлетворенный клинических 1. Это подчеркивает важность разработки новых молекулярно целевой терапии. Обычные химиотерапевтические, что целевой пролиферации клеток опухоли не доказаны, чтобы быть эффективным в лечении метастатической болезни и таким образом новые стратегии должны быть ориентированы самого метастатического процесса 2. В текущей статье рассматриваются практические аспекты относительно нового типа ex vivo легких метастазов модели, пробирного легочных метастазов (PuMA), разработанный Мендоса и коллеги3, который обеспечивает полезный инструмент в раскрытии новых молекулярные драйверы в легких метастазов прогрессии в OS 4,5. Прежде чем продолжить, однако, было бы целесообразно кратко затронуть несколько текущих моделей метастазов, и как PuMA модель предлагает несколько преимуществ по сравнению с обычными в vitro assays.
Самые экспериментальные модели используются для изучения метастазов составляют in vitro и in vivo систем, которые охарактеризовать конкретный шаг или несколько шагов метастатического каскада. Эти шаги включают в себя: 1) опухолевых клеток, переход от первичной опухоли, 2) intravasation в близлежащих сосудов (кровь или лимфатическую) и транзита в циркуляции, 3) арест на дополнительный сайт, 4) кровоподтек и выживания на дополнительном сайте, 5) образование микрометастазы и 6) рост в васкуляризированной метастазов (рис. 1). В vitro модели метастазов может включать 2-мерной миграции (2D) и 3-мерные (3D) Matrigel вторжения анализов, которые рассматриваются в других местах подробно 6. Для моделей в естественных условиях , два часто используемых модель системы включают в себя: 1) спонтанное метастазов модель является, где опухолевые клетки orthotopically вводят в конкретных тканей типа сформировать местные опухоль, которая спонтанно проливает метастатического клетки в отдаленные места; 2) метастазов в экспериментальной модели является, где опухолевые клетки вводят в кровеносный сосуд, вверх по течению органа-мишени. Например хвост инъекции Вену опухолевых клеток приводит к развития легких метастазов5,7,8. Другие экспериментальные метастазов модели включают в себя инъекции опухолевых клеток селезенки или брыжеечных вен, что приводит в развитии метастазов в печени9,10. Уэлч 11подробно обсуждаются практические соображения в отношении этих моделей в естественных условиях . Другая модель в естественных условиях , используется для изучения метастазов в педиатрических сарком является модель имплантации подкапсулярный опухоли почечной функции почек, которая приводит в формировании местной опухоли и спонтанное метастазов легких 12,13. Технически более требовательных техники такие как прижизненной videomicroscopy могут непосредственно визуализировать, в режиме реального времени, взаимодействия между метастазами раковых клеток и microvasculature метастатического узла (т.е. легких или печени) как описано Макдональда14 и Entenberg15, или рак ячейки кровоподтек в chorioallantoic мембраны, как описано на Ким 16.
PuMA модель является ex vivo, тканях экспланта легких, закрытые культуры системы где флуоресцентные опухолевых клеток может быть продольно наблюдается рост через микроскопии флуоресцирования в течение месяца (см. рис. 2а). Эта модель воспроизводятся на начальных стадиях колонизации (шаги 3-5) легких в метастатических Каскад. Некоторые основные преимущества модели PuMA над обычными в vitro модели: 1) предоставляет возможность продольно измерять рост клеток метастатического рака в 3D микроокружения, который сохраняет множество функций легких микроокружения в VIVO 3; 2) puMA позволяет исследователю оценить ли нокдаун кандидат ген или наркотиков лечения имеет анти метастатического деятельности в контексте микроокружения 3D легких; 3 модель PuMA является гибкой со многими типами платформ микроскопии флуоресцирования (Рисунок 2B) как widefield микроскопии флуоресцирования или сканирование лазерная конфокальная микроскопия, приведены примеры каждого из них в рисунке 2 c и D, соответственно. Этой статье мы обсудим, как использовать модель PuMA для получения продольной визуализации данных на метастатический рост расширенной зеленого флуоресцентного белка (eGFP)-выражая, клетки человека высоких и низких метастатического остеосаркома (МННГ и HOS клеток, соответственно) с помощью низкий увеличение widefield флуоресценции. Также обсуждаются примеры изображений Люминесцентную краску, которая этикетки паренхимы легких и красный флуоресцентный белок, которую генетических репортер, который этикетки митохондрий в OS клеток в Пума модели с помощью конфокальной микроскопии лазерное сканирование.
Protocol
Representative Results
Discussion
Следующие технические статьи описывает некоторые практические аспекты модели PuMA в изучении легких колонизации в OS. Некоторые важнейшие шаги в протоколе, где исследователи должны проявлять особую осторожность, включают следующее:
) катетеризации трахеи. Трахеи могут бы?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы хотели бы поблагодарить доктора Арнульфо Мендоса, который обеспечивал подготовку в технике PuMA. Кроме того мы хотели бы признать Drs. Чанд Кханна, Сьюзен Гарфилд (NCI/низ) и Сэм Апарисио (до н.э. Рак Агентство) для обеспечения использования их микроскопов в ходе этого исследования. Это исследование было поддержано (частично) интрамуральных исследовательской программы национальных институтов здравоохранения, центр для исследований рака, отделение детской онкологии. M.M.L. была поддержана национальной институтов из интрамуральных посещения сотрудник программы здравоохранения (премия 15335) и в настоящее время поддерживается Джоан Паркер стипендий в исследованиях метастазов. Британской Колумбии рак Фонда поддерживается P.H.S..
Materials
| Table 2 | |||
| Cell culture reagents for A-media, B-media, and complete media | |||
| MNNG-HOS | ATCC | CRL-1547 | highly metastatic OS cell line |
| HOS | ATCC | CRL-1543 | poorly metastatic OS cell line |
| MG63.3 | Amy LeBlanc Laboratory (NCI) | N/A | highly metastatic OS cell line |
| MG63 | ATCC | CRL-1427 | poorly metastatic OS cell line |
| 10X M199 media | Thermofisher | 11825015 | Base media for A-media and B-media |
| Distilled Water (sterilized) | Thermofisher | 15230-147 | Component of A-media & B-media |
| 7.5% sodium bicarbonate solution | Thermofisher | 25080094 | Component of A-media & B-media |
| Hydrocortizone | Sigma-Alrich | H6909 | Component of A-media & B-media |
| Retinol acetate-water soluable | Sigma-Alrich | R0635-5MG | Component of A-media & B-media |
| Penicillin/Streptomycin 10X concentrated (10000 U/ml) solution | Thermofisher | 15140122 | Component of A-media & B-media, complete media. |
| Bovine insulin solution (10mg/ml) | Sigma-Alrich | I0516-5ML | Component of A-media & B-media |
| DMEM, high glucose | Thermofisher | 11965092 | Base media of Complete Media |
| L-Glutamine (200 mM) | Thermofisher | 25030081 | Component of Complete Media |
| Fetal Bovine Serum | Thermofisher | 16000044 | Component of Complete Media |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Thermofisher | 14190144 | Used in cell culture. |
| Hank’s Buffered Salts Solution, no calcium, no magnesium, no phenol red | Thermofisher | 14175095 | Used to resuspend cell pellet prior to injection |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Thermofisher | 25200114 | Used in cell culture. |
| DAR4M | Enzo | ALX-620-069-M001 | Used to label lung parenchyma. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Table 3 | |||
| Materials for PuMA | |||
| Zeiss 710 Confocal LSM | Zeiss | N/A | Upright LSM confocal microscope |
| Zeiss 780 Confocal LSM | Zeiss | N/A | Inverted LSM confocal microscope |
| SCID mice | Charles River | N/A | NOD.CB17-Prkdcscid/NcrCrl, female, age 6-8 weeks |
| GelFoam | Harvard Apparatus | 59-9863 | Used as a support for lung tissue sections. |
| SeaPlaque Agarose | Lonza | 50100 | Used during insufflation of the lung. |
| 1 ml syringe with 27 gauge needle | Fisherscientific | 14-826-87 | Used for tail vein injection. |
| 10 ml syringe | BD | 309604 | Used for insufflation of the lung. |
| 20 gauge catheter | Terumo | SR-OX2032CA | Used during insufflation of the lung. |
| Abbott IV extension set (30", Sterile) | Medisca | 8342 | Used during insufflation of the lung. |
| Alcohol swabs | BD | 326895 | For wiping tail vein before injection |
| Sterile surgical gloves | Fisherscientific | Varies with size | Asceptic handing of mouse lungs |
| 30 cm ruler | Staples | Used for insufflation of the lung. | |
| Support stand for ruler | Pipette.com | HS29022A | Used for insufflation of the lung. |
| 35 mm glass-bottomed culture dish | Ibidi | 81158 | Used during imaging of lung slices |
| Absorbent Underpads with Waterproof Moisture Barrier | VWR | 56617-014 | Used to line the sterile work area in the biological hood. |
| Catgut Plain Absorbable Suture | Braun | N/A | Used to tie off cannulated trachea. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Table 4 | |||
| Surgical instruments for PuMA | |||
| Micro Dissecting Scissors 3.5" Straight Sharp/Sharp | Roboz | RS-5910 | For cutting lung sections |
| 4” (10 cm) Long Serrated Straight Extra Delicate 0.5mm Tip | Roboz | RS-5132 | For manipulating/holding lung sections. |
| 4” (10 cm) Long Serrated Slight Curve 0.8mm Tip | Roboz | RS5135 | For manipulating/holding lung sections. |
| Thumb Dressing Forceps; Serrated; Delicate; 4.5" Length; 1.3 mm Tip Width | Roboz | RS-8120 | For general dissection. |
| Thumb Dressing Forceps 4.5" Serrated 2.2 mm Tip Width | Roboz | RS-8100 | For general dissection. |
| Extra Fine Micro Dissecting Scissors 3.5" Straight Sharp/Sharp, 20mm blade | Roboz | RS-5880 | For general dissection. |
| Knapp Scissors; Straight; Sharp-Blunt; 27mm Blade Length; 4" Overall Length | Roboz | RS-5960 | For general dissection. |
References
- Khanna, C., et al. Toward a drug development path that targets metastatic progression in osteosarcoma. Clin Cancer Res. 20 (16), 4200-4209 (2014).
- Steeg, P. S. Perspective: The right trials. Nature. 485 (7400), S58-S59 (2012).
- Mendoza, A., et al. Modeling metastasis biology and therapy in real time in the mouse lung. J Clin Invest. 120 (8), 2979-2988 (2010).
- Hong, S. H., Ren, L., Mendoza, A., Eleswarapu, A., Khanna, C. Apoptosis resistance and PKC signaling: distinguishing features of high and low metastatic cells. Neoplasia. 14 (3), 249-258 (2012).
- Lizardo, M. M., et al. Upregulation of Glucose-Regulated Protein 78 in Metastatic Cancer Cells Is Necessary for Lung Metastasis Progression. Neoplasia. 18 (11), 699-710 (2016).
- Pouliot, N., Pearson, H. B., Burrows, A. Investigating Metastasis Using In Vitro Platforms. Metastatic Cancer: Clinical and Biological Perspectives. , (2012).
- Cameron, M. D., et al. Temporal progression of metastasis in lung: cell survival, dormancy, and location dependence of metastatic inefficiency. Cancer Res. 60 (9), 2541-2546 (2000).
- Morrow, J. J., et al. mTOR inhibition mitigates enhanced mRNA translation associated with the metastatic phenotype of osteosarcoma cells in vivo. Clinical Cancer Research. , (2016).
- Varghese, H. J., et al. In vivo videomicroscopy reveals differential effects of the vascular-targeting agent ZD6126 and the anti-angiogenic agent ZD6474 on vascular function in a liver metastasis model. Angiogenesis. 7 (2), 157-164 (2004).
- Khanna, C., Hunter, K. Modeling metastasis in vivo. Carcinogenesis. 26 (3), 513-523 (2005).
- Welch, D. R. Technical considerations for studying cancer metastasis in vivo. Clin Exp Metastasis. 15 (3), 272-306 (1997).
- Somasekharan, S. P., et al. YB-1 regulates stress granule formation and tumor progression by translationally activating G3BP1. J Cell Biol. 208 (7), 913-929 (2015).
- El-Naggar, A. M., et al. Translational Activation of HIF1alpha by YB-1 Promotes Sarcoma Metastasis. Cancer Cell. 27 (5), 682-697 (2015).
- MacDonald, I. C., Groom, A. C., Chambers, A. F. Cancer spread and micrometastasis development: quantitative approaches for in vivo models. Bioessays. 24 (10), 885-893 (2002).
- Entenberg, D., et al. A permanent window for the murine lung enables high-resolution imaging of cancer metastasis. Nat Methods. 15 (1), 73-80 (2018).
- Kim, Y., et al. Quantification of cancer cell extravasation in vivo. Nat Protoc. 11 (5), 937-948 (2016).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Underwood, E. E. . Quantitative stereology. , (1970).
- Tanaka, K., et al. In vivo optical imaging of cancer metastasis using multiphoton microscopy: a short review. Am J Transl Res. 6 (3), 179-187 (2014).
- Prouty, A. M., Wu, J., Lin, D. T., Camacho, P., Lechleiter, J. D. Multiphoton laser scanning microscopy as a tool for Xenopus oocyte research. Methods Mol Biol. 322, 87-101 (2006).
- Bijgaart, R. J., Kong, N., Maynard, C., Plaks, V. Ex vivo Live Imaging of Lung Metastasis and Their Microenvironment. J Vis Exp. (108), e53741 (2016).
- Guha, M., et al. Mitochondrial retrograde signaling induces epithelial-mesenchymal transition and generates breast cancer stem cells. Oncogene. 33 (45), 5238-5250 (2014).
- Ren, L., Morrow, J. J., et al. Positively selected enhancer elements endow osteosarcoma cells with metastatic competence. . Nat Med. , (2018).
- Ren, L., et al. Metabolomics uncovers a link between inositol metabolism and osteosarcoma metastasis. Oncotarget. 8 (24), 38541-38553 (2017).
- Ren, L., et al. Characterization of the metastatic phenotype of a panel of established osteosarcoma cells. Oncotarget. 6 (30), 29469-29481 (2015).
