Metastatik akciğer kolonizasyon pulmoner metastaz tahlil kullanarak osteosarkom içinde eğitim pratik düşünceler
Summary
Bu makalede, pulmoner metastaz tahlil (PuMA) Protokolü’nün ayrıntılı bir açıklama sağlamak için hedeftir. Bu model araştırmacılar metastatik osteosarkom (OS) hücre büyümesini widefield floresan veya confocal mikroskop lazer tarama kullanarak akciğer dokusunda çalışmaya izin verir.
Abstract
Pulmoner metastaz tahlil (PuMA) bir ex vivo akciğer explant ve araştırmacılar tarafından Floresans mikroskobu osteosarkom (OS) akciğer kolonizasyon Biyoloji çalışmaya izin verir kapalı hücre kültür sistemi olduğunu. Bu makalede Protokolü’nün ayrıntılı bir açıklama ve metastatik büyüme widefield veya confocal floresan mikroskopi platformlar kullanarak bağlı görüntü veri alma örnekleri ele alınmaktadır. PuMA modeli esnekliğini araştırmacılar akciğer microenvironment içinde işletim sistemi hücrelerinin büyümesini sadece eğitim için aynı zamanda zaman içinde Anti-metastatik tedavi etkilerini değerlendirmek için izin verir. Akciğer parankimi ile OS hücre etkileşimlerin görülmemiş, yüksek çözünürlükte görüntüleme için confocal mikroskobu sağlar. Ayrıca, PuMA modeli floresan boyalar veya floresan protein genetik gazetecilere ile birleştirildiğinde, araştırmacılar akciğer microenvironment, hücresel ve hücre altı yapıları, gen fonksiyon ve metastatik OS hücrelerdeki organizatörü etkinlik eğitim görebilirsiniz. PuMA modeli osteosarkom araştırmacılar yeni metastaz Biyoloji keşfetmek ve roman Anti-metastatik, hedeflenen tedavilerin etkinliğini değerlendirmek için yeni bir araç sağlar.
Introduction
Pediatrik hastalarda metastatik osteosarkom (OS) için geliştirilmiş sonuçları hala kritik karşılanmamış klinik ihtiyaç 1kalır. Bu yeni tatlı hedefli tedaviler geliştirmenin önemi vurgular. Hedef tümör hücre çoğalması metastatik hastalık ve böylece roman stratejileri tedavisinde etkili olduğu kanıtlanmış değil geleneksel chemotherapeutics metastatik işlemi 2hedeflemesi gerekir. Geçerli makalenin ex vivo akciğer metastazı modeli, yeni keşfetmek yararlı bir araç sağlayan Mendoza ve iş arkadaşları3tarafından geliştirilen pulmoner metastaz tahlil (PuMA) nispeten yeni bir tür pratik yönlerini ele almaktadır. Moleküler sürücüleri akciğer metastazı ilerleme OS 4,5. Devam etmeden önce ancak, kısaca metastaz çeşitli geçerli modeller dokunmak ihtiyatlı olur ve deneyleri nasıl PuMA modeli geleneksel vitro birkaç avantaj sunar.
Metastaz çalışırdım en deneysel modeller belirli bir adımı veya metastatik art arda birkaç adımını özetlemek vitro ve in vivo sistemleri oluşturmaktadır. Bu adımlar içerir: 1) tümör hücreleri birincil tümör, 2) intravasation uzak içine Yakındaki gemiler (kan veya lenf) ve dolaşım içinde transit geçiş 3) tutukla ikincil site, 4) ekstravazasyonu ve hayatta kalma ikincil alanında 5) oluşumu micrometastases ve 6) büyüme içine bozukluklarına Metastazlari (şekil 1). Metastaz vitro modelleri 2-boyutlu (2D) geçiş içerebilir ve hangi içinde gözden 3 boyutlu (3D) Matrigel işgali deneyleri, başka bir yerde 6detay. Vivo modellerinde, iki yaygın olarak kullanılan model sistemleri içerir: 1) spontan metastaz modeli nerede bir tümör hücreleri orthotopically kendiliğinden metastatik hücreleri tutuyor yerel bir tümör oluşturmak için belirli doku türü enjekte olmasıdır uzak sitelere; 2) deneysel metastaz modeli nerede tümör hücrelerinin damar akıntıya karşı hedef organ enjekte edilmiş olur. Örneğin, bir kuyruk ven enjeksiyon tümör hücreleri sonuçları geliştirme akciğer Metastazlari5,7,8. Diğer deneysel metastaz modelleri dalak ya da karaciğer metastaz9,10gelişiminde sonuçları Mezenterik ven içine tümör hücrelerinin enjeksiyon içerir. Bu vivo içinde modellerin pratik hususlar Welch 11tarafından ayrıntılı olarak ele alınmıştır. Metastaz Pediatrik sarkomları içinde çalışmak için kullanılan başka bir vivo içinde modeli yerel tümör oluşumu ve spontan metastaz için akciğerler 12,13sonuçları böbrek böbrek subkapsüler tümör implantasyon modelidir. Teknik açıdan daha zorlu bir tekniği gibi intravital videomicroscopy can doğrudan görselleştirmek, buna metastatik kanser hücreleri ve metastatik bir site microvasculature gerçek zamanlı, Hofstede (yani. akciğer veya karaciğer)14 MacDonald tarafından açıklandığı gibi ve Entenberg15veya kanser hücre ekstravazasyonu chorioallantoic zarda Kim 16tarafından tanımlandığı gibi.
PuMA modelin bir ex vivo, Akciğer doku explant, kapalı kültür sistemi olduğunu nerede floresan tümör hücrelerinin büyümesini boyuna Floresans mikroskobu ile bir ay boyunca görülebilir ( şekil 2Abakınız). Bu model akciğer kolonizasyon (Adım 3-5) metastatik cascade başlangıç evresinde beyannamedir. Geleneksel vitro modelleri PuMA modelinin büyük bazı avantajları vardır: 1) içinde boyuna metastatik kanser hücre büyüme akciğer microenvironment özelliklerinin çoğu korur bir 3D microenvironment ölçmek için bir fırsat sağlar vivo 3; 2) puMA nakavt aday gen veya uyuşturucu tedavi Anti-metastatik etkinlik 3D akciğer microenvironment bağlamında olup olmadığını değerlendirmek araştırmacı sağlar; 3) Floresans mikroskobu platformlar (2B rakam) widefield Floresans mikroskobu ya da confocal mikroskobu lazer tarama birçok türde ile esnek PuMA modelidir, şekil 2C & Diçinde her örnekler gösterilir, anılan sıraya göre. Bu makalede PuMA modeli gelişmiş yeşil flüoresan protein (eGFP) metastatik büyüme üzerine boyuna görüntüleme verileri elde etmek için nasıl kullanılacağı ele alınacak-ifade, insan yüksek ve düşük metastatik osteosarkom hücreleri (MNNG ve HOS hücreleri, sırasıyla) kullanarak düşük-büyütme widefield floresan. Akciğer parankimi etiketleri floresan boya ve mitokondri içinde OS etiketleri genetik muhabir PuMA model confocal mikroskobu lazer tarama kullanarak hücreleri kırmızı-floresan protein Imaging örnekler de ele alınmıştır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aşağıdaki teknik makale akciğer kolonizasyon OS eğitim PuMA modeli pratik bazı yönlerini açıklar. Nerede araştırmacılar ekstra dikkat protokolündeki bazı önemli adımlar şunlardır:
a) nefes borusu cannulation. Nefes borusu çevresindeki kas ve bağ dokusu diseksiyon sırasında kolayca zarar görebilir. Buna ek olarak, iğne kateterin kolayca nefes borusu itti olabilir. Nasıl iğne eğimi Trakea kanül eklerken girdiği için dikkat edin.
b) Delme …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
PuMA teknik eğitimde sağlanan Dr Arnulfo Mendoza teşekkür etmek istiyorum. Ayrıca, bu çalışma süresince kendi mikroskoplar kullanımını sağlamak için Drs. Chand Khanna, Susan Garfield (ncı/NIH) ve Sam Aparicio (BC Kanser Ajansı) kabul etmek istiyorum. Bu araştırma (kısmen) ulusal sağlık enstitüleri, kanser araştırmaları, Pediatrik Onkoloji şube Merkezi Intramural araştırma programı tarafından desteklenmiştir. M.M.L. ulusal kurumları, sağlık Intramural ziyaret adam Program tarafından (Ödülü 15335) destek verdi ve şu anda bir Joan Parker bursu metastaz araştırma tarafından desteklenmektedir. P.H.S. British Columbia kanser Vakfı tarafından desteklenmektedir.
Materials
| Table 2 | |||
| Cell culture reagents for A-media, B-media, and complete media | |||
| MNNG-HOS | ATCC | CRL-1547 | highly metastatic OS cell line |
| HOS | ATCC | CRL-1543 | poorly metastatic OS cell line |
| MG63.3 | Amy LeBlanc Laboratory (NCI) | N/A | highly metastatic OS cell line |
| MG63 | ATCC | CRL-1427 | poorly metastatic OS cell line |
| 10X M199 media | Thermofisher | 11825015 | Base media for A-media and B-media |
| Distilled Water (sterilized) | Thermofisher | 15230-147 | Component of A-media & B-media |
| 7.5% sodium bicarbonate solution | Thermofisher | 25080094 | Component of A-media & B-media |
| Hydrocortizone | Sigma-Alrich | H6909 | Component of A-media & B-media |
| Retinol acetate-water soluable | Sigma-Alrich | R0635-5MG | Component of A-media & B-media |
| Penicillin/Streptomycin 10X concentrated (10000 U/ml) solution | Thermofisher | 15140122 | Component of A-media & B-media, complete media. |
| Bovine insulin solution (10mg/ml) | Sigma-Alrich | I0516-5ML | Component of A-media & B-media |
| DMEM, high glucose | Thermofisher | 11965092 | Base media of Complete Media |
| L-Glutamine (200 mM) | Thermofisher | 25030081 | Component of Complete Media |
| Fetal Bovine Serum | Thermofisher | 16000044 | Component of Complete Media |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Thermofisher | 14190144 | Used in cell culture. |
| Hank’s Buffered Salts Solution, no calcium, no magnesium, no phenol red | Thermofisher | 14175095 | Used to resuspend cell pellet prior to injection |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Thermofisher | 25200114 | Used in cell culture. |
| DAR4M | Enzo | ALX-620-069-M001 | Used to label lung parenchyma. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Table 3 | |||
| Materials for PuMA | |||
| Zeiss 710 Confocal LSM | Zeiss | N/A | Upright LSM confocal microscope |
| Zeiss 780 Confocal LSM | Zeiss | N/A | Inverted LSM confocal microscope |
| SCID mice | Charles River | N/A | NOD.CB17-Prkdcscid/NcrCrl, female, age 6-8 weeks |
| GelFoam | Harvard Apparatus | 59-9863 | Used as a support for lung tissue sections. |
| SeaPlaque Agarose | Lonza | 50100 | Used during insufflation of the lung. |
| 1 ml syringe with 27 gauge needle | Fisherscientific | 14-826-87 | Used for tail vein injection. |
| 10 ml syringe | BD | 309604 | Used for insufflation of the lung. |
| 20 gauge catheter | Terumo | SR-OX2032CA | Used during insufflation of the lung. |
| Abbott IV extension set (30", Sterile) | Medisca | 8342 | Used during insufflation of the lung. |
| Alcohol swabs | BD | 326895 | For wiping tail vein before injection |
| Sterile surgical gloves | Fisherscientific | Varies with size | Asceptic handing of mouse lungs |
| 30 cm ruler | Staples | Used for insufflation of the lung. | |
| Support stand for ruler | Pipette.com | HS29022A | Used for insufflation of the lung. |
| 35 mm glass-bottomed culture dish | Ibidi | 81158 | Used during imaging of lung slices |
| Absorbent Underpads with Waterproof Moisture Barrier | VWR | 56617-014 | Used to line the sterile work area in the biological hood. |
| Catgut Plain Absorbable Suture | Braun | N/A | Used to tie off cannulated trachea. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Table 4 | |||
| Surgical instruments for PuMA | |||
| Micro Dissecting Scissors 3.5" Straight Sharp/Sharp | Roboz | RS-5910 | For cutting lung sections |
| 4” (10 cm) Long Serrated Straight Extra Delicate 0.5mm Tip | Roboz | RS-5132 | For manipulating/holding lung sections. |
| 4” (10 cm) Long Serrated Slight Curve 0.8mm Tip | Roboz | RS5135 | For manipulating/holding lung sections. |
| Thumb Dressing Forceps; Serrated; Delicate; 4.5" Length; 1.3 mm Tip Width | Roboz | RS-8120 | For general dissection. |
| Thumb Dressing Forceps 4.5" Serrated 2.2 mm Tip Width | Roboz | RS-8100 | For general dissection. |
| Extra Fine Micro Dissecting Scissors 3.5" Straight Sharp/Sharp, 20mm blade | Roboz | RS-5880 | For general dissection. |
| Knapp Scissors; Straight; Sharp-Blunt; 27mm Blade Length; 4" Overall Length | Roboz | RS-5960 | For general dissection. |
References
- Khanna, C., et al. Toward a drug development path that targets metastatic progression in osteosarcoma. Clin Cancer Res. 20 (16), 4200-4209 (2014).
- Steeg, P. S. Perspective: The right trials. Nature. 485 (7400), S58-S59 (2012).
- Mendoza, A., et al. Modeling metastasis biology and therapy in real time in the mouse lung. J Clin Invest. 120 (8), 2979-2988 (2010).
- Hong, S. H., Ren, L., Mendoza, A., Eleswarapu, A., Khanna, C. Apoptosis resistance and PKC signaling: distinguishing features of high and low metastatic cells. Neoplasia. 14 (3), 249-258 (2012).
- Lizardo, M. M., et al. Upregulation of Glucose-Regulated Protein 78 in Metastatic Cancer Cells Is Necessary for Lung Metastasis Progression. Neoplasia. 18 (11), 699-710 (2016).
- Pouliot, N., Pearson, H. B., Burrows, A. Investigating Metastasis Using In Vitro Platforms. Metastatic Cancer: Clinical and Biological Perspectives. , (2012).
- Cameron, M. D., et al. Temporal progression of metastasis in lung: cell survival, dormancy, and location dependence of metastatic inefficiency. Cancer Res. 60 (9), 2541-2546 (2000).
- Morrow, J. J., et al. mTOR inhibition mitigates enhanced mRNA translation associated with the metastatic phenotype of osteosarcoma cells in vivo. Clinical Cancer Research. , (2016).
- Varghese, H. J., et al. In vivo videomicroscopy reveals differential effects of the vascular-targeting agent ZD6126 and the anti-angiogenic agent ZD6474 on vascular function in a liver metastasis model. Angiogenesis. 7 (2), 157-164 (2004).
- Khanna, C., Hunter, K. Modeling metastasis in vivo. Carcinogenesis. 26 (3), 513-523 (2005).
- Welch, D. R. Technical considerations for studying cancer metastasis in vivo. Clin Exp Metastasis. 15 (3), 272-306 (1997).
- Somasekharan, S. P., et al. YB-1 regulates stress granule formation and tumor progression by translationally activating G3BP1. J Cell Biol. 208 (7), 913-929 (2015).
- El-Naggar, A. M., et al. Translational Activation of HIF1alpha by YB-1 Promotes Sarcoma Metastasis. Cancer Cell. 27 (5), 682-697 (2015).
- MacDonald, I. C., Groom, A. C., Chambers, A. F. Cancer spread and micrometastasis development: quantitative approaches for in vivo models. Bioessays. 24 (10), 885-893 (2002).
- Entenberg, D., et al. A permanent window for the murine lung enables high-resolution imaging of cancer metastasis. Nat Methods. 15 (1), 73-80 (2018).
- Kim, Y., et al. Quantification of cancer cell extravasation in vivo. Nat Protoc. 11 (5), 937-948 (2016).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Underwood, E. E. . Quantitative stereology. , (1970).
- Tanaka, K., et al. In vivo optical imaging of cancer metastasis using multiphoton microscopy: a short review. Am J Transl Res. 6 (3), 179-187 (2014).
- Prouty, A. M., Wu, J., Lin, D. T., Camacho, P., Lechleiter, J. D. Multiphoton laser scanning microscopy as a tool for Xenopus oocyte research. Methods Mol Biol. 322, 87-101 (2006).
- Bijgaart, R. J., Kong, N., Maynard, C., Plaks, V. Ex vivo Live Imaging of Lung Metastasis and Their Microenvironment. J Vis Exp. (108), e53741 (2016).
- Guha, M., et al. Mitochondrial retrograde signaling induces epithelial-mesenchymal transition and generates breast cancer stem cells. Oncogene. 33 (45), 5238-5250 (2014).
- Ren, L., Morrow, J. J., et al. Positively selected enhancer elements endow osteosarcoma cells with metastatic competence. . Nat Med. , (2018).
- Ren, L., et al. Metabolomics uncovers a link between inositol metabolism and osteosarcoma metastasis. Oncotarget. 8 (24), 38541-38553 (2017).
- Ren, L., et al. Characterization of the metastatic phenotype of a panel of established osteosarcoma cells. Oncotarget. 6 (30), 29469-29481 (2015).
