Consideraciones prácticas en el estudio de colonización pulmonar metastásico en Osteosarcoma usando el ensayo de metástasis pulmonar
Summary
El objetivo de este artículo es proporcionar una descripción detallada del protocolo para el ensayo de metástasis pulmonar (PuMA). Este modelo permite a los investigadores a estudiar el crecimiento de células de osteosarcoma metastásico (OS) en el tejido del pulmón usando un widefield fluorescencia o un microscopio de escaneo láser confocal.
Abstract
El ensayo de metástasis pulmonar (PuMA) es un ex vivo el explante de pulmón y el sistema de cultivo de célula cerrada que permite a los investigadores a estudiar la biología de la colonización del pulmón en osteosarcoma (OS) por microscopía de fluorescencia. Este artículo proporciona una descripción detallada del protocolo y discute ejemplos de obtención de datos de imagen en crecimiento metastático con campo amplio o plataformas de microscopia confocal de la fluorescencia. La flexibilidad del modelo PuMA permite a los investigadores a estudiar no sólo el crecimiento de las células de la OS en el microambiente del pulmón, sino también evaluar los efectos de la terapéutica anti-metastásico con el tiempo. La microscopia confocal permite la proyección de imagen de alta resolución, sin precedentes de las interacciones de la célula de OS con la parenquimia de pulmón. Por otra parte, cuando se combina el modelo de PuMA con colorantes fluorescentes o reporteros genético proteína fluorescente, los investigadores pueden estudiar el microambiente del pulmón, las estructuras celulares y subcelulares, funciones de los genes y actividad del promotor en células metastásicas de OS. El modelo PuMA proporciona una nueva herramienta para los investigadores de osteosarcoma a descubrir la nueva biología de la metástasis y evaluar la actividad de nuevas terapias anti-metastásicas, dirigidas.
Introduction
Mejores resultados para los pacientes pediátricos con osteosarcoma metastático (OS) sigue siendo una crítica necesidad clínica 1. Esto subraya la importancia de desarrollar nuevas terapias dirigidas molecularmente. Quimioterápicos convencionales que la proliferación de células de tumor de destino no han demostrado para ser eficaces en el tratamiento de enfermedad metastásica y, por tanto, estrategias novedosas deben apuntar el proceso metastático sí mismo 2. El actual artículo discute los aspectos prácticos de un tipo relativamente nuevo de ex vivo el modelo metástasis de pulmón, el ensayo de metástasis pulmonar (PuMA) desarrollado por Mendoza y colaboradores3, que proporciona una herramienta útil para descubrir nuevas Controladores moleculares en la progresión de la metástasis de pulmón en OS 4,5. Antes, sin embargo, sería prudente mencionar brevemente varios modelos actuales de la metástasis y cómo el modelo PuMA ofrece varias ventajas sobre los convencionales en vitro ensayos.
Modelos más experimentales utilizados para estudiar la metástasis forman parte de sistemas in vitro e in vivo que recapitulan un determinado paso o varios pasos de la cascada metastásica. Estos pasos incluyen: células de tumor 1) migrar lejos el tumor primario, 2) intravasación en vasos cercanos (arterial o linfática) y tránsito dentro de la circulación, 3) detener en el sitio secundario, 4) la extravasación y la supervivencia en el sitio secundario, 5) formación de micrometástasis y 6) crecimiento en metástasis vascularizadas (figura 1). Modelos in vitro de la metástasis pueden incluir migración (2D) 2 dimensiones y 3 dimensiones (3D) ensayos de invasión de Matrigel cuales son revisados en detallan en otra parte 6. Para los modelos en vivo , los dos sistemas modelo utilizados incluyen: 1) el modelo de metástasis espontáneas es donde las células de un tumor son orthotopically inyectado en un tipo de tejido específico para formar un tumor local que espontáneamente arroja las células metastásicas a sitios distantes; 2) el modelo experimental de metástasis es donde las células del tumor se inyectan en los vasos sanguíneos contra la corriente del órgano blanco. Por ejemplo, una cola vena inyección de células de tumor en el pulmón de desarrollo metástasis5,7,8. Otros modelos de metástasis experimentales incluyen la inyección de las células del tumor en el bazo o en la vena mesentérica que se traduce en el desarrollo de las metástasis del hígado9,10. Consideraciones prácticas de estos modelos en vivo se discuten en detalle por Welch 11. Otro en vivo modelo usado para estudiar la metástasis en sarcomas pediátricos es el modelo de implantación del tumor subcapsular renal riñones que resulta en la formación local del tumor y la metástasis espontánea a los pulmones 12,13. Una técnica más técnicamente exigente como videomicroscopía intravital puede visualizar directamente, en tiempo real, interacciones entre las células de cáncer metastásico y la microvascularización de un sitio metastásico (es decir. pulmón o hígado) descrito por MacDonald14 y Entenberg15o extravasación de células de cáncer en la membranas corioalantoideas como descrito por Kim 16.
El modelo de PuMA es una ex vivo, explantes de tejido pulmonar, el sistema de cultivo cerrado donde el crecimiento de las células del tumor fluorescente puede longitudinalmente observar mediante microscopía de fluorescencia durante un período de un mes (ver figura 2A). Este modelo recoge las etapas iniciales de la colonización del pulmón (pasos 3 a 5) en la cascada metastásica. Algunas ventajas importantes del modelo PuMA sobre modelos convencionales en vitro son: 1) ofrece una oportunidad para medir el crecimiento de la célula de cáncer metastásico en un microambiente 3D que conserva muchas características del microambiente pulmón longitudinalmente en vivo 3; 2) puMA permite al investigador evaluar si la caída de un candidato gene o droga tiene actividad anti-metastásico en el contexto de un microambiente de pulmón 3D; 3) el modelo de PuMA es flexible con muchos tipos de plataformas de la microscopia de la fluorescencia (figura 2B) como microscopía de fluorescencia de campo amplio o microscopia confocal de láser, ejemplos de cada uno se muestran en la figura 2 y D, respectivamente. Este artículo discutirá cómo utilizar el modelo de PuMA para obtener datos de imágenes longitudinales sobre el crecimiento metastásico de mayor proteína verde fluorescente (eGFP)-expresar, las células de osteosarcoma metastásico altas y bajas humanas (MNNG y HOS células, respectivamente) mediante fluorescencia de campo amplio de baja magnificación. También se discuten ejemplos de la imagen un tinte fluorescente que las etiquetas de la parenquimia de pulmón y una proteína fluorescente roja reportero genética que etiquetas mitocondrias en OS de células en el modelo de PuMA con microscopía de escaneo láser confocal.
Protocol
Representative Results
Discussion
El siguiente artículo técnico describe algunos aspectos prácticos del modelo PuMA en el estudio de colonización pulmonar en OS. Algunos pasos críticos en el protocolo donde los investigadores deben tomar cuidado adicional son los siguientes:
a) canulación de la tráquea. La tráquea puede ser dañada fácilmente mientras que disecar el músculo circundante y el tejido conectivo. Además, la aguja del catéter puede introducirse fácilmente a través de la tráquea. Preste atención a có…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nos gustaría dar las gracias a Dr. Arnulfo Mendoza quien proporcionó capacitación en la técnica de PuMA. Además, nos gustaría reconocer los Drs. Chand Khanna, Susan Garfield (NCI/NIH) y Sam Aparicio (BC Cancer Agency) para proporcionar el uso de los microscopios en el transcurso de este estudio. Esta investigación fue apoyada (en parte) por el programa de investigación intramuros de los institutos nacionales de salud, centro de investigación del cáncer, rama de oncología pediátrica. M.M.L. fue apoyado por el programa nacional de institutos de salud intramuros visitando compañeros (Premio 15335) y actualmente es apoyado por una beca de Parker de Joan en la investigación de metástasis. P.H.S. es apoyado por la Fundación del cáncer de Columbia Británica.
Materials
| Table 2 | |||
| Cell culture reagents for A-media, B-media, and complete media | |||
| MNNG-HOS | ATCC | CRL-1547 | highly metastatic OS cell line |
| HOS | ATCC | CRL-1543 | poorly metastatic OS cell line |
| MG63.3 | Amy LeBlanc Laboratory (NCI) | N/A | highly metastatic OS cell line |
| MG63 | ATCC | CRL-1427 | poorly metastatic OS cell line |
| 10X M199 media | Thermofisher | 11825015 | Base media for A-media and B-media |
| Distilled Water (sterilized) | Thermofisher | 15230-147 | Component of A-media & B-media |
| 7.5% sodium bicarbonate solution | Thermofisher | 25080094 | Component of A-media & B-media |
| Hydrocortizone | Sigma-Alrich | H6909 | Component of A-media & B-media |
| Retinol acetate-water soluable | Sigma-Alrich | R0635-5MG | Component of A-media & B-media |
| Penicillin/Streptomycin 10X concentrated (10000 U/ml) solution | Thermofisher | 15140122 | Component of A-media & B-media, complete media. |
| Bovine insulin solution (10mg/ml) | Sigma-Alrich | I0516-5ML | Component of A-media & B-media |
| DMEM, high glucose | Thermofisher | 11965092 | Base media of Complete Media |
| L-Glutamine (200 mM) | Thermofisher | 25030081 | Component of Complete Media |
| Fetal Bovine Serum | Thermofisher | 16000044 | Component of Complete Media |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Thermofisher | 14190144 | Used in cell culture. |
| Hank’s Buffered Salts Solution, no calcium, no magnesium, no phenol red | Thermofisher | 14175095 | Used to resuspend cell pellet prior to injection |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Thermofisher | 25200114 | Used in cell culture. |
| DAR4M | Enzo | ALX-620-069-M001 | Used to label lung parenchyma. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Table 3 | |||
| Materials for PuMA | |||
| Zeiss 710 Confocal LSM | Zeiss | N/A | Upright LSM confocal microscope |
| Zeiss 780 Confocal LSM | Zeiss | N/A | Inverted LSM confocal microscope |
| SCID mice | Charles River | N/A | NOD.CB17-Prkdcscid/NcrCrl, female, age 6-8 weeks |
| GelFoam | Harvard Apparatus | 59-9863 | Used as a support for lung tissue sections. |
| SeaPlaque Agarose | Lonza | 50100 | Used during insufflation of the lung. |
| 1 ml syringe with 27 gauge needle | Fisherscientific | 14-826-87 | Used for tail vein injection. |
| 10 ml syringe | BD | 309604 | Used for insufflation of the lung. |
| 20 gauge catheter | Terumo | SR-OX2032CA | Used during insufflation of the lung. |
| Abbott IV extension set (30", Sterile) | Medisca | 8342 | Used during insufflation of the lung. |
| Alcohol swabs | BD | 326895 | For wiping tail vein before injection |
| Sterile surgical gloves | Fisherscientific | Varies with size | Asceptic handing of mouse lungs |
| 30 cm ruler | Staples | Used for insufflation of the lung. | |
| Support stand for ruler | Pipette.com | HS29022A | Used for insufflation of the lung. |
| 35 mm glass-bottomed culture dish | Ibidi | 81158 | Used during imaging of lung slices |
| Absorbent Underpads with Waterproof Moisture Barrier | VWR | 56617-014 | Used to line the sterile work area in the biological hood. |
| Catgut Plain Absorbable Suture | Braun | N/A | Used to tie off cannulated trachea. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Table 4 | |||
| Surgical instruments for PuMA | |||
| Micro Dissecting Scissors 3.5" Straight Sharp/Sharp | Roboz | RS-5910 | For cutting lung sections |
| 4” (10 cm) Long Serrated Straight Extra Delicate 0.5mm Tip | Roboz | RS-5132 | For manipulating/holding lung sections. |
| 4” (10 cm) Long Serrated Slight Curve 0.8mm Tip | Roboz | RS5135 | For manipulating/holding lung sections. |
| Thumb Dressing Forceps; Serrated; Delicate; 4.5" Length; 1.3 mm Tip Width | Roboz | RS-8120 | For general dissection. |
| Thumb Dressing Forceps 4.5" Serrated 2.2 mm Tip Width | Roboz | RS-8100 | For general dissection. |
| Extra Fine Micro Dissecting Scissors 3.5" Straight Sharp/Sharp, 20mm blade | Roboz | RS-5880 | For general dissection. |
| Knapp Scissors; Straight; Sharp-Blunt; 27mm Blade Length; 4" Overall Length | Roboz | RS-5960 | For general dissection. |
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