Valutazione del processo di migrazione e l'invasione delle cellule: un confronto dello Scratch Video basati su microscopio ferita test e le analisi della camera di Boyden
Summary
Questo studio segnala due diversi metodi per l’analisi di migrazione e l’invasione delle cellule: l’analisi della camera di Boyden e l’in vitro dei video microscopio analisi basata a guarigione. Vengono descritti i protocolli per questi due esperimenti, e vengono confrontati i loro vantaggi e svantaggi.
Abstract
Le capacità di migrazione e invasione delle cellule del tumore sono contributori principali a ricorrenza e progressione del cancro. Molti studi hanno esplorato le capacità di migrazione e invasione di capire come diffondere le cellule tumorali, con l’obiettivo di sviluppare nuove strategie di trattamento. Analisi delle basi cellulari e molecolari di queste abilità ha portato per la caratterizzazione della mobilità delle cellule e le proprietà fisico-chimiche del citoscheletro e microambiente cellulare. Per molti anni, l’analisi della camera di Boyden e il dosaggio di ferita gratta e Vinci sono stati le tecniche standard per studiare la migrazione e l’invasione delle cellule. Tuttavia, queste due tecniche hanno limitazioni. L’analisi della camera di Boyden è difficile e richiede tempo, e il saggio di gratta e Vinci della ferita ha scarsa riproducibilità. Lo sviluppo delle moderne tecnologie, soprattutto in microscopia, ha aumentato la riproducibilità del dosaggio zero ferita. Utilizzando sistemi di analisi potente, un microscopio video “in incubatrice” utilizzabile per fornire analisi automatica e in tempo reale di invasione e migrazione cellulare. Lo scopo di questa carta è di segnalare e confrontare i due dosaggi usati per studiare la migrazione e l’invasione delle cellule: l’analisi della camera di Boyden e un ottimizzato in vitro dei video basati su microscopio zero ferita dosaggio.
Introduction
Migrazione e l’invasione delle cellule sono coinvolti nella diffusione delle cellule tumorali, che è la causa principale di resistenza al trattamento1 e può portare a locoregionale o ricorrenza metastatica dopo cancro trattamento2. La transizione epiteliale-mesenchimale (EMT) è il processo iniziale di invasione-migrazione delle cellule in cui il cancro cellule passare da un epiteliali ad un fenotipo mesenchimale. E-caderina è un marcatore extracellulare del fenotipo epiteliale3, e l’espressione aumentata di N-caderina e il vimentin è caratteristico del fenotipo mesenchimale4. Migrazione dipende anche la capacità intrinseca delle cellule tumorali ad invadere la matrice extracellulare (ECM) attraverso l’azione di metalloproteasi di matrice5.
Questo meccanismo di invasione – migrazione è stata descritta per il cancro in molti luoghi, particolarmente in testa e del collo cancro6. Molti ricercatori si sono concentrati sui processi di migrazione e invasione di capire meglio come le cellule tumorali diffondere nella speranza che questa conoscenza porterà a nuove strategie di trattamento. È fondamentale che questi studi sono effettuati usando le analisi affidabili e riproducibili.
Analisi in vitro della motilità cellulare può essere impegnativo. Sviluppato molti anni fa, l’analisi della camera di Boyden è considerato lo standard per l’invasione – migrazione analisi7. Tuttavia, è che richiede tempo e spesso è impreciso. Un secondo test è la guarigione dosaggio8, che consiste nel fare un graffio su una coltura monostrato cellulare e acquisizione di immagini di invasione delle cellule e la migrazione ad intervalli di tempo. Questa tecnica è stata ampiamente criticata a causa delle grandi variazioni tra i risultati di due prove consecutive. Tuttavia, l’applicazione delle moderne tecnologie, soprattutto in microscopia, ha migliorato la riproducibilità del dosaggio zero ferita. I microscopi video possono essere facilmente introdotto nelle incubatrici e in grado di generare immagini in tempo reale della migrazione cellulare. Questi dispositivi registrano dati microscopici e forniscono analisi automatica della confluenza delle cellule della ferita nel tempo. Lo scopo di questa carta è di descrivere le analisi della camera di Boyden e il dosaggio ottimizzato ferita gratta e Vinci e per discutere i vantaggi e le debolezze di ogni approccio.
Protocol
Representative Results
Discussion
Segnaliamo qui due diverse modalità per studiare il processo di invasione e migrazione cellulare. L’analisi di questo processo è importante per comprendere i fattori coinvolti nella ricorrenza metastatica, che potrebbe essere spiegato con aumentata motilità di una sottopopolazione delle cellule di cancro chiamato cancro cellule staminali10,11.
L’esperimento di camera di Boyden è uno il più delle volte usato invasione e migrazione …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Queste tecniche sono state sviluppate con il supporto di LabEx primi (ANR-11-LABX-0063), il piano di Contrat-Etat-regione (CPER) nel quadro scientifico di ETOILE (CPER 2009-2013) e Lyric Grant INCa-DGOS-4664.
Materials
| Fetal Calf Serum Gold | GE Healthcare | A15-151 | |
| Hydrocortisone water soluble | Sigma-Aldrich | H0396-100MG | |
| Penicillin/Streptomycin 100 X | Dominique Dutscher | L0022-100 | |
| DMEM | Gibco | 61965-026 | |
| F12 Nut Mix (1X) + GlutaMAX-I | Gibco | 31765-027 | |
| EGF | Promega | G5021 | The solution must be prepared just before use because it is very unstable |
| Z1 coulter particle | Beckman Coulter | 6605698 | |
| Optical microscope | Olympus | CKX31 | |
| SQ20B cell line | Gift from the John Little’s Laboratory | – | |
| Wound Maker | Essen Bioscience | 4494 | Store in safe and dry place |
| 96-well ImageLock Plate | Essen Bioscience | 4379 | |
| CoolBox 96F System with CoolSink 96F | Essen Bioscience | 1500-0078-A00 | |
| CoolBox with M30 System | Essen Bioscience | 1500-0078-A00 | |
| Boyden Insert | Dominique Dutcher | 353097 | |
| Boyden Coated Insert | Dominique Dutcher | 354483 | Store at -20 °C |
| Companion 24-well Plate | Dominique Dutcher | 353504 | |
| BD Matrigel standard | BD BioScience | BD 354234 | Store at -20°C. |
| RAL 555 Staining Kit | RAL Diagnostics | 361550 | Store in safe and dry place |
| Microcentrifuge tubes | Eppendorf | 33511 |
References
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