細胞浸潤および移行プロセスの評価: ビデオ顕微鏡ベースのスクラッチの比較創傷アッセイと boyden 教授区域の試金
Summary
細胞浸潤と移行の解析のための 2 つの方法の事例分析: ボイデン室アッセイと体外ビデオ顕微鏡を用いた創傷治癒アッセイ。これらの 2 つの実験のプロトコルの記述とのメリットとデメリットを比較します。
Abstract
腫瘍細胞の浸潤と移行の能力は、癌の進行や再発の主な要因です。多くの研究は、新しい治療戦略の開発の目的で、がん細胞を普及させる方法を理解するための移行と侵攻能力を探検しました。これらの能力の分子・細胞基盤の解析は、細胞移動の特性と細胞骨格と細胞の微小環境の物理化学的性質につながっています。長年にわたりボイデン室アッセイとスクラッチ傷アッセイは、細胞浸潤と移行を検討する標準的な手法をされています。ただし、これらの 2 つの手法には、制限があります。ボイデン室アッセイは難しく、時間がかかり、スクラッチ傷の試金、低再現性。顕微鏡、特に現代の技術の開発は、スクラッチ傷測定の再現性を増加しています。強力な解析システムを使用して、「インキュベーター」ビデオ顕微鏡は細胞の遊走と浸潤の自動リアルタイム分析を提供するために使用できます。本稿の目的は、レポートおよび細胞浸潤と移行を研究するために使用 2 つの試金を比較する: ボイデン室アッセイと、最適化された体外ビデオ顕微鏡ベース スクラッチ傷の試金。
Introduction
細胞浸潤と移行治療1への抵抗の主な原因である癌細胞の普及に関与しているし、局所または転移性がん治療2再発につながることができます。上皮間葉転換 (EMT) は、細胞浸潤移行の癌細胞からに切り替えると、上皮間葉系の表現型の初期プロセスです。E-カドヘリンは上皮性の表現型3の細胞マーカーと N 型カドヘリンおよびビメンチンの発現増加間葉系表現型4の特徴であります。移行は、マトリックス分解酵素5の作用により細胞外のマトリックス (ECM) を侵略する癌細胞の本質的な能力によっても異なります。
この侵略 – 移行メカニズムは、頭頸部がん6を中心に、多くの場所で癌のため記載されています。多くの研究者は、がん細胞がこの知識は新たな治療戦略につながることを願って発信方法をよりよく理解する移行と侵入のプロセスに焦点を当てています。信頼性が高く、再現性のある試金を使用してこれらの研究を実行することが重要です。
細胞の運動性のin vitro解析は挑戦することができます。何年も前に開発、ボイデン室アッセイに侵攻-移行解析7の標準と見なされます。しかし、それは時間がかかるし、はしばしば不正確。2 番目のテストは、創傷治癒の試金8、含み細胞の単層培養に傷を作り、細胞浸潤と一定の時間間隔で移行の画像をキャプチャします。この手法は、2 つの連続したテストの結果の大きい変化のため広く批判されています。しかし、特に、顕微鏡での近代的な技術のアプリケーション スクラッチ傷アッセイの再現性の向上が。ビデオ顕微鏡インキュベーターで簡単に導入することができ、細胞遊走のリアルタイム画像を生成することができます。これらのデバイスは顕微鏡データを記録し、時間をかけて傷細胞合流点の自動解析を提供します。本稿の目的はボイデン室分析と最適化されたスクラッチ傷の試金を記述する、長所とそれぞれのアプローチの弱点を議論します。
Protocol
Representative Results
Discussion
我々 はここに細胞浸潤と移行過程を研究する 2 つの異なるモダリティを報告します。このプロセスの分析は、がん幹細胞10,11と呼ばれる癌細胞の亜集団の増加運動によって説明されるかもしれない転移再発に関与する因子を理解することが重要です。
ボイデン室実験は最も頻繁に使用される 1 つを探索する技術細胞浸潤と移行…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
これらの技術は、LabEx 素数 (ANR-11-LABX-0063)、エトワール (CPER 2009 ~ 2013 年)、叙情詩的なグラント インカ DGOS-4664 の科学的なフレームワーク内で契プラン クーデタークーデター地域 (CPER) の支援を受けて開発されました。
Materials
| Fetal Calf Serum Gold | GE Healthcare | A15-151 | |
| Hydrocortisone water soluble | Sigma-Aldrich | H0396-100MG | |
| Penicillin/Streptomycin 100 X | Dominique Dutscher | L0022-100 | |
| DMEM | Gibco | 61965-026 | |
| F12 Nut Mix (1X) + GlutaMAX-I | Gibco | 31765-027 | |
| EGF | Promega | G5021 | The solution must be prepared just before use because it is very unstable |
| Z1 coulter particle | Beckman Coulter | 6605698 | |
| Optical microscope | Olympus | CKX31 | |
| SQ20B cell line | Gift from the John Little’s Laboratory | – | |
| Wound Maker | Essen Bioscience | 4494 | Store in safe and dry place |
| 96-well ImageLock Plate | Essen Bioscience | 4379 | |
| CoolBox 96F System with CoolSink 96F | Essen Bioscience | 1500-0078-A00 | |
| CoolBox with M30 System | Essen Bioscience | 1500-0078-A00 | |
| Boyden Insert | Dominique Dutcher | 353097 | |
| Boyden Coated Insert | Dominique Dutcher | 354483 | Store at -20 °C |
| Companion 24-well Plate | Dominique Dutcher | 353504 | |
| BD Matrigel standard | BD BioScience | BD 354234 | Store at -20°C. |
| RAL 555 Staining Kit | RAL Diagnostics | 361550 | Store in safe and dry place |
| Microcentrifuge tubes | Eppendorf | 33511 |
References
- Friedl, P., Wolf, K. Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms. Nat Rev Cancer. 3 (5), 362-374 (2003).
- Moncharmont, C., et al. Radiation-enhanced cell migration/invasion process: A review. Crit Rev Oncol Hematol. , (2014).
- Burdsal, C. A., Damsky, C. H., Pedersen, R. A. The role of E-cadherin and integrins in mesoderm differentiation and migration at the mammalian primitive streak. Development. 118 (3), 829-844 (1993).
- Chen, C., Zimmermann, M., Tinhofer, I., Kaufmann, A. M., Albers, A. E. Epithelial-to-mesenchymal transition and cancer stem(-like) cells in head and neck squamous cell carcinoma. Cancer Lett. 338 (1), 47-56 (2013).
- Nelson, A. R., Fingleton, B., Rothenberg, M. L., Matrisian, L. M. Matrix metalloproteinases: biologic activity and clinical implications. J Clin Oncol. 18 (5), 1135-1149 (2000).
- Smith, A., Teknos, T. N., Pan, Q. Epithelial to mesenchymal transition in head and neck squamous cell carcinoma. Oral Oncol. 49 (4), 287-292 (2013).
- Chen, H. -. C. Boyden chamber assay. Meth Mol Biol. 294, 15-22 (2005).
- Rodriguez, L. G., Wu, X., Guan, J. -. L. Wound-healing assay. Meth Mol Biol. 294, 23-29 (2005).
- Piaton, E., et al. Technical recommendations and best practice guidelines for May-Grünwald-Giemsa staining: literature review and insights from the quality assurance. Ann Path. 35 (4), 294-305 (2015).
- Moncharmont, C., et al. Targeting a cornerstone of radiation resistance: cancer stem cell. Cancer lett. 322 (2), 139-147 (2012).
- Moncharmont, C., et al. Carbon ion irradiation withstands cancer stem cells’ migration/invasion process in Head and Neck Squamous Cell Carcinoma (HNSCC). Oncotarget. 7 (30), 47738-47749 (2016).
- Gilormini, M., Wozny, A. -. S., Battiston-Montagne, P., Ardail, D., Alphonse, G., Rodriguez-Lafrasse, C. Isolation and Characterization of a Head and Neck Squamous Cell Carcinoma Subpopulation Having Stem Cell Characteristics. J Vis Exp: JoVE. (111), (2016).
