Évaluation In Vitro dommages à l’ADN à l’aide du test des comètes

Summary

Le test des comètes est une méthode efficace pour détecter les lésions de l’ADN dont l’ADN simple et double-brin se brise. Nous décrivons la comète neutres et alcalins des essais pour mesurer les lésions de l’ADN dans les cellules cancéreuses pour évaluer les effets thérapeutiques de la chimiothérapie.

Abstract

Dommages à l’ADN sont un phénomène commun pour chaque cellule pendant sa durée de vie et sont défini comme une altération de la structure chimique de l’ADN génomique. Les thérapies contre le cancer, tels que la radio – et chimiothérapie, introduisent une quantité énorme d’autres dommages à l’ADN, menant à l’arrêt du cycle cellulaire et l’apoptose pour limiter la progression du cancer. Évaluation quantitative des dommages à l’ADN au cours du traitement expérimental contre le cancer est une étape clé pour justifier l’efficacité d’un agent génotoxique. Dans cette étude, nous nous concentrons sur un essai d’électrophorèse unicellulaire, également connu sous le nom du test des comètes, qui permet de quantifier unique et ADN double-brin breaks in vitro. Le test des comètes est une méthode de quantification des dommages ADN qui est efficace et facile à exécuter, et a de faibles exigences de temps/budget et reproductibilité élevée. Ici, nous mettons en évidence l’utilité de l’essai de comet pour une étude préclinique en évaluant l’effet génotoxique de la polythérapie olaparib/témozolomide aux cellules de gliome U251.

Introduction

Le test des comètes a été tout d’abord développé par Ostling et Johanson en 1984 en démontrant que la migration de l’ADN de fragments de noyaux en vertu d’une condition neutre¹. La technique a été développée plus tard par Singh et al., montrant qu’une condition alcaline a considérablement augmenté la spécificité et la reproductibilité du dosage². Depuis lors, le test des comètes neutre est surtout utilisé pour détecter les cassures double brin d’ADN, alors que le test des comètes alcaline est plus sensible pour les petits montants de dommages à l’ADN, simples et doubles brins de l’ADN brise, sites alcali-labile, ADN ou ADN-protéines de réticulation et les cassures de l’ADN monocaténaire associées à l’excision incomplète réparation sites^3,4. Les deux tests permettent la visualisation des fragments d’ADN et offrent un moyen simple d’évaluer quantitativement les dommages à l’ADN. Le test des comètes est considéré comme une méthode sensible pour des études toxicologiques in vitro et in vivo génétiques et s’applique à des domaines de recherche différents, tels que la sélection précoce de candidat-médicament, surveillance de l’environnement, la biosurveillance humaine, et aux droits fondamentaux dans les lésions de l’ADN de recherche et de réparation⁵.

Le principe de l’analyse est que dans un champ électrique, fragments d’ADN migre hors du corps de nucléoïde (également connu sous le nom la « tête de la comète ») et forment une tache d’ADN dans le gel d’agarose (également connu sous le nom la « queue de la comète »). Nucléotides de coloration, l’étendue des dommages à l’ADN peut être quantifié en analysant « comètes » formés par l’électrophorèse de cette cellule. Calcul du moment queue peut plus aider à comparer les dommages à l’ADN entre les différents groupes expérimentaux. Par rapport aux méthodes traditionnelles de détection des dommages de l’ADN, le test des comètes est directe, sensible, peu coûteux et relativement simple.

Radiothérapie et chimiothérapie est des stratégies communes pour le traitement du cancer en générant monocaténaire et ADN double brin ruptures dans les chromosomes⁶. La promotion récente en inhibiteurs de réparation de l’ADN permet un effet génotoxique plus efficace par la chimiothérapie de combinaison et donc potentiellement réduit les effets secondaires systémiques telles que l’anémie, infection et la moelle osseuse répression^{7, 8}. dans la présente étude, nous avons montré l’enquête d’un inhibiteur de poly (ADP-ribose) polymérase (PARP), olaparib (Ola)⁹. PARP est une protéine nucléaire abondante et est responsable de la réparation d’excision de base de l’ADN en formant un polymère de poly (ADP-ribose)¹⁰. Témozolomide (TMZ) est un agent alkylant oralement disponible et a été largement utilisé pour le traitement des patients gliome. En utilisant le test des comètes pour quantifier les dommages à l’ADN, nous démontrons que combinant olaparib avec témozolomide profondément augmente les dommages à l’ADN dans les cellules de gliome, qui suggère la polythérapie olaparib/témozolomide est une stratégie efficace pour le traitement des gliomes, comparé avec le témozolomide seul¹¹.

Protocol

1. préparer des réactifs 1 x PBS diluer à 100 mL de PBS 10 x avec 900 mL dH 2 O et ajuster le pH à 7.4 à l’aide d’un pH-mètre. Conserver à température ambiante. Solution de lyse (LS) préparer 2,5 M NaCl, EDTA de disodium de 100 mM, 10 mM Tris base et 200 mM NaOH dans 900 mL dH 2 O ; il prend généralement environ 20 min pour permettre le mélange dissoudre complètement. Ajuster le pH à 10 à l’aide d…

Representative Results

Le présent protocole décrit un flux de travail étape par étape pour l’exécution de test comète et analyse de données (Figure 1). Résultats de dosages du comète alcalins et neutres ont montré que la queue de la comète de cellules d’U251 traités à la doxorubicine (1 µM, 20 h) était plus longue et a une plus forte intensité de l’ADN, ce qui suggère une accumulation importante de fragments d’ADN en raison de la chimiothérapie (<strong cl…

Discussion

Le test des comètes est un outil efficace pour mesurer les cassures simples ou double brin de l’ADN au niveau cellulaire. L’essai a été largement appliquée comme un « étalon or » dans les études concernant la génotoxicité et biosurveillance¹³, allant des lésions base ADN crosslinks, développement de médicaments et sites sensibles d’alcali. Dans la présente étude, nous avons montré deux protocoles distincts d’étape par étape pour des dosages de comète neutres et alcalin…

Materials

Reagents
10x PBS(Ca++, Mg++ free)	TEKnova	P0196
NaCl	Sigma	S5886
EDTA	TEKnova	E0308
Trizma base	Sigma	T1503
NaOH	Sigma	72068
Sodium lauryl sarcosinate	Sigma	L7414
Triton X-100	Sigma	93443
Sodium acetate	Sigma	32318
Glacial acetic acid	Sigma	695092
Ammonium acetate	Sigma	A1542
SYBR Green	Invitrogen	S33102
Low melting point agarose	Invitrogen	16520
Agarose	Invitrogen	16500
95% ethanol	WARNER-GRAHAM	#64-17-5
Trypsin	GIBICO	25300-054
Name	Company	Catalog Number	Comments
Consumables
Glass tissue slides	ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES	63422-11
Kimwipes	KIMberly-Clark
1.5 mL Microcentrifuge Tubes	DENVILLE
Pipette Tips	SHARP
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipments
Microwave	Avanti
Waterbath	PRECISION
Horizontal electrophoresis chamber	TREVIGEN	Cometassay ES II
Power supply	Bio-Rad
Incubator	Quincy Lab	Model 12-140E
Fluorescent microscope	Zeiss	LSM700
Micropipettor	Eppendorf