Vitro DNA hasarı kuyruklu yıldız tahlil kullanarak değerlendirmek
Summary
Kuyruklu yıldız tahlil tek ve çift iplikçikli DNA içeren DNA hasarı tatili algılamak için verimli bir yöntemdir. Kemoterapi tedavi edici etkisini değerlendirmek için kanser hücrelerinin DNA hasarı ölçmek için alkali ve tarafsız kuyruklu yıldız deneyleri tarif.
Abstract
DNA hasar her hücre için ortak bir fenomen onun ömrü ve genomik DNA’ın kimyasal yapısı bir değişiklik tanımlanır. Gibi radyo ve kemoterapi, kanser tedavileri kanser ilerleme sınırlamak için hücre döngüsü tutuklama ve Apoptozis yol ek DNA hasar çok büyük miktarda tanıtmak. DNA hasarı kantitatif değerlendirilmesi deneysel kanser tedavisi sırasında genotoksik aracısı etkinliğini haklı göstermek için önemli bir adımdır. Bu çalışmada, biz bir tek hücre elektroforez yöntemi, olarak da bilinen tek ölçmek kuyruklu yıldız tahlil odaklanmak ve iki iplikçikli DNA vitrotatili. Kuyruklu yıldız tahlil verimli ve gerçekleştirmek kolay bir DNA hasarı miktar yöntemidir ve düşük saat/bütçe talepleri ve yüksek tekrarlanabilirlik vardır. Burada, olaparib/temozolomide kombinasyon tedavisi U251 tümörü hücrelere genotoksik etkisini değerlendirerek kuyruklu yıldız tahlil preklinik bir çalışma için yardımcı programı vurgulayın.
Introduction
Kuyruklu yıldız tahlil ilk Ostling ve Johanson tarafından 1984 yılında çekirdeği bir nötr koşul1altında üzerinden göç DNA parçaları göstererek geliştirilmiştir. Teknik bir alkali durumu önemli ölçüde artan özgüllük ve tekrarlanabilirlik tahlil2gösterilen Singh vdtarafından daha sonra geliştirildi. O zamandan beri tarafsız kuyruklu yıldız tahlil çoğunlukla ise alkali kuyruklu yıldız tahlil DNA hasar, tek gibi küçük miktarlar için daha duyarlı ve Çift Kişilik iplikçik DNA tatili, alkali değişken siteler, DNA-DNA çift iplikçikli DNA tatili, algılamak için kullanılır veya DNA-protein cross-linking ve DNA tek iplikçikli kırılmalar eksik eksizyon ile ilişkili siteleri3,4onarın. Her iki deneyleri görselleştirme parçalanmış DNA’ın izin ve kantitatif DNA hasarı değerlendirmek için basit bir yol sağlar. Kuyruklu yıldız tahlil içinde in vitro ve in vivo genetik toksikolojik çalışmalar için hassas bir yöntemi olarak kabul edilir ve erken uyuşturucu-aday seçimi, çevresel izleme, insan biomonitoring gibi farklı araştırma alanları için geçerlidir, ve araştırma DNA hasarı ve5onarım temel.
Tahlil bir elektrik alanı altında parçalanmış DNA (olarak da bilinen “kuyruklu yıldız kafa”) çevrili vücut dışına geçirir ve özel jel (olarak da bilinen “kuyruklu yıldız kuyruğu”) bir DNA leke oluşturur ilkedir. Nükleotit boyama ile DNA hasar ölçüde “kuyruklu yıldızlar bu tek hücre Elektroforez tarafından kurulan” analiz ederek sayısal. Kuyruk an hesaplanması daha fazla DNA hasar farklı deneysel grupları arasında karşılaştırmak için yardımcı olabilir. DNA hasar tespiti geleneksel yöntemlere göre kuyruklu yıldız tahlil doğrudan, hassas, ucuz ve oldukça basit olduğunu.
Radyoterapi ve chemotherapies kanser tedavisi için ortak stratejiler tek iplikçik oluşturarak ve Çift Kişilik iplikçik DNA kromozom6‘ tatili. DNA onarım inhibitörleri son gelişme kombinasyon kemoterapi tarafından daha etkili bir genotoksik etkiyi sağlar ve bu nedenle, potansiyel olarak anemi, enfeksiyon ve kemik iliği baskılanması7, gibi sistemik yan etkileri azaltır 8. bu çalışmada, bir Poli (ADP-riboz) polimeraz (PARP) inhibitörü, olaparib (Ola)9incelenmesi gösterdik. PARP bol bir nükleer protein ve Poli (ADP-riboz) polimer10oluşturarak DNA baz eksizyon tamiri için sorumludur. Temozolomide (TMZ) sözlü olarak kullanılabilir bir bölücü ve yaygın olarak tümörü hasta tedavi için kullanılan. Kuyruklu yıldız tahlil DNA hasarı ölçmek için kullanarak, biz olaparib derinden temozolomide ile birleştirerek olaparib/temozolomide kombinasyon tedavisi tümörü, tedavi etmek için etkili bir strateji olduğunu göstermektedir DNA hasarı gliyom hücrelerdeki geliştirir göstermek temozolomide yalnız11ile karşılaştırıldığında.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kuyruklu yıldız tahlil tek ve iki iplikçikli DNA sonları hücresel düzeyde ölçmek için etkili bir araçtır. Tahlil yaygın olarak13genotoxicity ve biomonitoring ile ilgili olarak, temel lezyonlar, DNA Glossar, ilaç geliştirme ve alkali hassas siteler arasında değişen çalışmalarda “altın standart” olarak uygulanmıştır. Bu da çalışmanın, sırasıyla alkali ve tarafsız kuyruklu yıldız deneyleri, iki ayrı adım adım protokollerde gösterdik. Tek hücre Elektroforez, flore…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu araştırma NIH, ncı ve CCR Intramural araştırma programı tarafından desteklenmiştir. Tüm yazarlar NIH, ncı ve CCR Intramural araştırma bursu aldı.
Materials
| Reagents | |||
| 10x PBS(Ca++, Mg++ free) | TEKnova | P0196 | |
| NaCl | Sigma | S5886 | |
| EDTA | TEKnova | E0308 | |
| Trizma base | Sigma | T1503 | |
| NaOH | Sigma | 72068 | |
| Sodium lauryl sarcosinate | Sigma | L7414 | |
| Triton X-100 | Sigma | 93443 | |
| Sodium acetate | Sigma | 32318 | |
| Glacial acetic acid | Sigma | 695092 | |
| Ammonium acetate | Sigma | A1542 | |
| SYBR Green | Invitrogen | S33102 | |
| Low melting point agarose | Invitrogen | 16520 | |
| Agarose | Invitrogen | 16500 | |
| 95% ethanol | WARNER-GRAHAM | #64-17-5 | |
| Trypsin | GIBICO | 25300-054 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Consumables | |||
| Glass tissue slides | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | 63422-11 | |
| Kimwipes | KIMberly-Clark | ||
| 1.5 mL Microcentrifuge Tubes | DENVILLE | ||
| Pipette Tips | SHARP | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipments | |||
| Microwave | Avanti | ||
| Waterbath | PRECISION | ||
| Horizontal electrophoresis chamber | TREVIGEN | Cometassay ES II | |
| Power supply | Bio-Rad | ||
| Incubator | Quincy Lab | Model 12-140E | |
| Fluorescent microscope | Zeiss | LSM700 | |
| Micropipettor | Eppendorf |
References
- Ostling, O., Johanson, K. J. Microelectrophoretic study of radiation-induced DNA damages in individual mammalian cells. Biochem Biophys Res Commun. 123 (1), 291-298 (1984).
- Singh, N. P., McCoy, M. T., Tice, R. R., Schneider, E. L. A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells. Exp Cell Res. 175 (1), 184-191 (1988).
- Tice, R. R., et al. Single cell gel/comet assay: guidelines for in vitro and in vivo genetic toxicology testing. Environ Mol Mutagen. 35 (3), 206-221 (2000).
- Shah, A. J., Lakkad, B. C., Rao, M. V. Genotoxicity in lead treated human lymphocytes evaluated by micronucleus and comet assays. Indian J Exp Biol. 54 (8), 502-508 (2016).
- Azqueta, A., Collins, A. R. The essential comet assay: a comprehensive guide to measuring DNA damage and repair. Arch Toxicol. 87 (6), 949-968 (2013).
- Goldstein, M., Kastan, M. B. The DNA damage response: implications for tumor responses to radiation and chemotherapy. Annu Rev Med. 66, 129-143 (2015).
- Gavande, N. S., et al. DNA repair targeted therapy: The past or future of cancer treatment?. Pharmacol Ther. 160, 65-83 (2016).
- Torgovnick, A., Schumacher, B. DNA repair mechanisms in cancer development and therapy. Front Genet. 6, 157 (2015).
- Weston, V. J., et al. The PARP inhibitor olaparib induces significant killing of ATM-deficient lymphoid tumor cells in vitro and in vivo. Blood. 116 (22), 4578-4587 (2010).
- Brown, J. S., O’Carrigan, B., Jackson, S. P., Yap, T. A. Targeting DNA Repair in Cancer: Beyond PARP Inhibitors. Cancer Discov. 7 (1), 20-37 (2017).
- Lu, Y., et al. Chemosensitivity of IDH1-Mutated Gliomas Due to an Impairment in PARP1-Mediated DNA Repair. Cancer Res. 77 (7), 1709-1718 (2017).
- Konca, K., et al. A cross-platform public domain PC image-analysis program for the comet assay. Mutat Res. 534 (1-2), 15-20 (2003).
- Valverde, M., Rojas, E. Environmental and occupational biomonitoring using the Comet assay. Mutat Res. 681 (1), 93-109 (2009).
- Collins, A. R. The comet assay for DNA damage and repair: principles, applications, and limitations. Mol Biotechnol. 26 (3), 249-261 (2004).
- Karbaschi, M., Cooke, M. S. Novel method for the high-throughput processing of slides for the comet assay. Sci Rep. 4, 7200 (2014).
