Valutazione In Vitro del DNA danni utilizzando test della cometa
Summary
Il test della cometa è un metodo efficace per rilevare danni al DNA compreso singolo e doppio filamento di DNA si rompe. Descriviamo la cometa alcalino e neutro saggi per misurare il danno del DNA in cellule di cancro per valutare l’effetto terapeutico della chemioterapia.
Abstract
Danno del DNA è un fenomeno comune per ogni cella durante la sua esistenza ed è definito come un’alterazione della struttura chimica del DNA genomico. Terapie del cancro, come la radio e la chemioterapia, introducono una quantità enorme di ulteriori danni al DNA, che conduce all’arresto del ciclo cellulare e apoptosi per limitare la progressione del cancro. Valutazione quantitativa del danno del DNA durante la terapia sperimentale del cancro è un passo fondamentale per giustificare l’efficacia di un agente genotossico. In questo studio, ci concentriamo su un’analisi di elettroforesi unicellulare, noto anche come il test della cometa, che si può quantificare singolo e doppio filamento DNA si rompe in vitro. Il test della cometa è un metodo di quantificazione del danno del DNA che è efficiente e facile da eseguire, e ha basse esigenze di budget di tempo e un’elevata riproducibilità. Qui, si evidenzia l’utilità di analisi della cometa per uno studio preclinico valutando l’effetto genotossico olaparib/temozolomide della terapia di combinazione di cellule di glioma U251.
Introduction
Il test della cometa è stato sviluppato da Ostling e Johanson nel 1984 dimostrando che la migrazione del DNA frammenti dai nuclei in un neutro condizione1. La tecnica venne successivamente sviluppata da Singh et al., mostrando che una condizione alcalina notevolmente aumentata la specificità e la riproducibilità del test2. Da allora, l’analisi della cometa neutro principalmente è usato per rilevare le rotture del doppio filamento del DNA, mentre l’analisi alcalina della cometa è più sensibile per piccoli importi di danno del DNA, compreso il singolo e doppio filamento del DNA si rompe, siti alcali-labili, DNA-DNA o Cross-linking del DNA-proteina e rotture del singolo filamento del DNA connesse con l’asportazione incompleta ripristino siti3,4. Entrambe le analisi permettono la visualizzazione di DNA frammentato e forniscono un modo semplice per valutare quantitativamente il danno del DNA. Il test della cometa è considerato come un metodo sensibile per gli studi tossicologici genetici in vitro e in vivo ed è applicabile ad aree di ricerca diversi, quali la selezione precoce di droga-candidato, monitoraggio ambientale, biomonitoraggio umano, e fondamentale ricercare in danno del DNA e riparazione5.
Il principio del test è che, in un campo elettrico, DNA frammentato migra fuori dal corpo di nucleoide (conosciuto anche come la “testa della cometa”) e forma una macchia di DNA in gel di agarosio (noto anche come “coda di cometa”). Con la colorazione del nucleotide nella misura di danno del DNA può essere quantificata analizzando “comete” formate da questo elettroforesi unicellulare. Calcolo del momento di coda può aiutare ulteriormente a confrontare il danno del DNA fra differenti gruppi sperimentali. Rispetto ai tradizionali metodi di rilevamento dei danni del DNA, il test della cometa è diretto, sensibile, poco costoso e relativamente semplice.
La radioterapia e la chemioterapia è strategie comuni per il trattamento del cancro generando filo singolo e doppio filamento DNA si rompe in cromosomi6. Il recente progresso nella inibitori di riparazione del DNA permette un più efficace effetto genotossico di chemioterapia di combinazione e quindi, potenzialmente riduce effetti collaterali sistemici quali l’anemia, infezioni e midollo osseo soppressione7, 8. in questo studio, abbiamo dimostrato l’inchiesta di un inibitore di poli (ADP-ribosio) polimerasi (PARP), olaparib (Ola)9. PARP è una proteina nucleare abbondante ed è responsabile della riparazione bassa di asportazione del DNA formando un polimero di poli (ADP-ribosio)10. Temozolomide (TMZ) è un agente alchilante orale disponibile ed è stato ampiamente usato per il trattamento di pazienti di glioma. Utilizzando l’analisi della cometa per quantificare il danno del DNA, dimostriamo che combinando olaparib con temozolomide profondamente migliora il danno del DNA in cellule del glioma, che suggerisce la terapia di combinazione di olaparib/temozolomide è una strategia efficace per il trattamento di gliomi, confrontato con temozolomide solo11.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il test della cometa è uno strumento efficace per misurare le rotture di singolo e doppio filamento del DNA a livello cellulare. Il dosaggio è stato ampiamente applicato come un “golden standard” negli studi per quanto riguarda la genotossicità e biomonitoraggio13, che vanno dalle lesioni della base, legami incrociati del DNA, lo sviluppo di farmaci e siti sensibili dell’alcali. Nello studio presente, abbiamo mostrato due distinti protocolli passo-passo per i dosaggi cometa alcalino e neutro, r…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questa ricerca è stata sostenuta dal programma di ricerca intramurale del NIH, NCI e CCR. Tutti gli autori ricevevano assegno di ricerca intramurale da NIH, NCI e CCR.
Materials
| Reagents | |||
| 10x PBS(Ca++, Mg++ free) | TEKnova | P0196 | |
| NaCl | Sigma | S5886 | |
| EDTA | TEKnova | E0308 | |
| Trizma base | Sigma | T1503 | |
| NaOH | Sigma | 72068 | |
| Sodium lauryl sarcosinate | Sigma | L7414 | |
| Triton X-100 | Sigma | 93443 | |
| Sodium acetate | Sigma | 32318 | |
| Glacial acetic acid | Sigma | 695092 | |
| Ammonium acetate | Sigma | A1542 | |
| SYBR Green | Invitrogen | S33102 | |
| Low melting point agarose | Invitrogen | 16520 | |
| Agarose | Invitrogen | 16500 | |
| 95% ethanol | WARNER-GRAHAM | #64-17-5 | |
| Trypsin | GIBICO | 25300-054 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Consumables | |||
| Glass tissue slides | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | 63422-11 | |
| Kimwipes | KIMberly-Clark | ||
| 1.5 mL Microcentrifuge Tubes | DENVILLE | ||
| Pipette Tips | SHARP | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipments | |||
| Microwave | Avanti | ||
| Waterbath | PRECISION | ||
| Horizontal electrophoresis chamber | TREVIGEN | Cometassay ES II | |
| Power supply | Bio-Rad | ||
| Incubator | Quincy Lab | Model 12-140E | |
| Fluorescent microscope | Zeiss | LSM700 | |
| Micropipettor | Eppendorf |
References
- Ostling, O., Johanson, K. J. Microelectrophoretic study of radiation-induced DNA damages in individual mammalian cells. Biochem Biophys Res Commun. 123 (1), 291-298 (1984).
- Singh, N. P., McCoy, M. T., Tice, R. R., Schneider, E. L. A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells. Exp Cell Res. 175 (1), 184-191 (1988).
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