ניטור השפעת Osmotic הלחץ על שלפוחית הפרשה, אקסוציטוזה
Summary
מתח osmotic משפיע אקסוציטוזה ואת כמות הנוירוטרנסמיטר שפורסמו במהלך תהליך זה. נדגים כיצד שילוב שיטות אלקטרוכימיות יחד עם מיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים יכול לשמש כדי לחקור את ההשפעה של לחץ אוסמוטי חוץ-תאית על פעילות אקסוציטוזה, שלפוחית quantal בגודל כמות הנוירוטרנסמיטר משוחרר במהלך אקסוציטוזה.
Abstract
הקלטה Amperometry של תאים נתון שוק אוסמוטי מראים כי תאים הפרשה להגיב על הלחץ הפיזי הזה על-ידי הפחתת הפעילות אקסוציטוזה ואת כמות הנוירוטרנסמיטר שוחרר מן שלפוחית באירועים אקסוציטוזה יחיד. הוצע כי הירידה נוירוטרנסמיטורים גורשו היא עקב שינויים במאפייני biophysical ממברנה כאשר תאים להתכווץ בתגובה ללחץ osmotic עם ההנחות זה שלפוחית הפרשה בציטופלסמה תא אינן מושפעות על ידי מתח osmotic חוץ-תאית. Amperometry הקלטה של אקסוציטוזה מפקחת מה הוא שוחרר מן התאים הרגע שלפוחית ולספות עם קרום פלזמה, אך אינו מספק מידע על תוכן שלפוחית לפני המיזוג שלפוחית מופעלת. לכן, על ידי שילוב של amperometry הקלטה עם שיטות אנליטיות משלימים אחרים המסוגלים אפיון השלפוחיות המוגלתיות הפרשה לפני אקסוציטוזה-תאים המופעלת מציע סקירה רחבה יותר לבחינת שלפוחית איך הפרשה ו בתהליך אקסוציטוזה מושפעים שוק אוסמוטי. כאן נתאר כיצד משלימים amperometry הקלטה עם cytometry אלקטרוכימי תאיים והדמיה מיקרוסקופ אלקטרונים (TEM) שידור ניתן להשתמש כדי לאפיין שינויים בגודל שלפוחית הפרשה ותוכן עצבי- תאים chromaffin ביחס אקסוציטוזה פעילות לפני ואחרי חשיפה osmotic מתח. על-ידי קישור כמותיים המידע שנצבר ניסויים באמצעות כל שלוש שיטות אנליטיות, מסקנות בעבר נעשו כי הפרשה שלפוחית להגיב ללחץ osmotic חוץ-תאית על ידי כיווץ גודל הקטנת גודל quantal שלפוחית כדי לשמור על ריכוז עצבי קבוע שלפוחית. ומכאן, זה נותן קצת הבהרה בנוגע למה שלפוחית, בתגובה osmotic מתח, להפחית את כמות נוירוטרנסמיטורים שפורסמו במהלך שחרור אקסוציטוזה. ההקלטות amperometric כאן מציינים שזה הוא תהליך הפיך, את שלפוחית לאחר הלם אוסמוטי והינם מחודשים עם נוירוטרנסמיטורים כאשר תאים שמוקם הם להחזירה לתוך סביבה מול.
Introduction
Chromaffin תאים בבלוטות יותרת הכליה הם תאים נוירואנדוקריניים שחרור נוירוטרנסמיטר מולקולות לתוך זרם הדם. מצב זה מתרחש דרך הסלולר התהליך הכרוך עגינה של פיוז’ן של שלפוחית מלאה נוירוטרנסמיטר, וכתוצאה מכך שחרור תוכן שלפוחית למרחב חוץ-תאית בתהליך הנקרא אקסוציטוזה. נוירוטרנסמיטרים תאים chromaffin (אדרנלין, ונוראדרנלין) מועבר על ידי קרום חלבונים לתוך שלפוחית גדול ליבה צפופה (LDCVs) ומאוחסנים באופן פעיל-ריכוזים גבוהים (~0.5-1 מ’)1,2. הצטברות של נוירוטרנסמיטורים פנימה LDCVs מושגת על ידי בזיקה של מולקולות קטכולאמין למטריקס חלבון intravesicular ליבה צפופה המורכבת chromogranin חלבונים (~ 169 mg/mL)3,4,5 ,6ופתרון קוקטייל intravesicular המכיל רכיבי מפתח קטכולאמין העמסה ואחסון לתוך שלפוחית כגון ATP (125-300 מ מ)7, Ca2 + (50-100 מיקרומטר פתרון ו ~ 40 מ מ חייב מטריקס חלבון)8,9מ ג2 + (5 מ מ), ascorbate (10-30 מ מ)10ו- pH של ~5.511,12. LDCVs לשמור על תנאי iso-osmotic עם תא הציטופלסמה (310 mOsm/kg)13, למרות הריכוז ממס תיאורטי בתוך השלפוחיות המוגלתיות לסכם עד יותר מ 750 מ”מ. ההרכב של הרכיבים intravesicular חיוני לא רק עבור העמסה ואחסון של catecholamines, אלא גם לצורך צבירת של מומסים בגבול למטריקס חלבון הליבה צפופה. זה מפחית באופן משמעותי את osmolarity של השלפוחיות המוגלתיות פוחת באופן משמעותי והוא יכול להשפיע על קטכולאמין סכום זה הוא שוחרר במהלך אקסוציטוזה5,6.
מחקרים על ההשפעה של לחץ אוסמוטי חוץ-תאית על התהליך אקסוציטוזה הקלטה amperometric דיווחו על הזאת לחץ אוסמוטי גבוה חוץ-תאית מעכב פעילות אקסוציטוזה ומפחיתה את מספר הנוירוטרנסמיטרים המופרשים יחיד שלפוחית תאים4,14,15,16,17,18,19. ההסברים מתצפיות אלה העריכו על שיפור אפשרי של הצפיפות macromolecular את האירועים של התא הציטופלסמה פיוז’ן שלפוחית מעכבות, שינוי במאפייני biophysical ממברנה להשפיע על מספר נוירוטרנסמיטורים שפורסמו במהלך אקסוציטוזה. מחשבות אלו הניחו כי מתח נפשי גבוה osmotic חוץ-תאית אינה משפיעה על גודל quantal שלפוחית, אשר מגדירה את מספר מולקולות עצבי המאוחסן בתא שלפוחית בשלב קודם של אקסוציטוזה מופעלות14, 15 , 17 , 19 , 20 , 21. במדידות amperometric של שחרור אקסוציטוזה תאים בודדים, microelectrode דיסק סיבי פחמן מושם בקשר הדוק עם פני השטח של התא, יצירת ערכה ניסוי למעלה מחקה את תצורת סינפסה, איפה amperometric אלקטרודה משמש22,גלאי postsynaptic (איור 1)23. על ידי גירוי תא אקסוציטוזה, אחד יכול לגרום שלפוחית מלאה עצבי נתיך עם קרום פלזמה התא ולשחרר חלק או את התוכן שלפוחית מלאה לחלל חוץ-תאית. מולקולות אלה הנוירוטרנסמיטר משוחרר על פני השטח של האלקטרודה ניתן להבחין electrochemically אם נוירוטרנסמיטורים הם electroactive (למשל, catecholamines) על-ידי החלת פוטנציאלי חמצון-חיזור של +700 mV vs אלקטרודה הפניה של Ag/AgCl . כתוצאה מכך, סדרה של קוצים הנוכחי לסמן את הגילוי של אירועים בודדים אקסוציטוזה. הנוכחי לעומת עקיבה זמן הקלטת amperometric, האזור שמתחת לכל ספייק amperometric יחיד מייצג את המטען זוהה לכל אירוע אקסוציטוזה, ניתן להמיר את החפרפרת של נוירוטרנסמיטרים שוחרר, באמצעות המשוואה פאראדיי. לפיכך, ההקלטות amperometric לספק מידע כמותי על כמות נוירוטרנסמיטורים שגורשו אירועים אקסוציטוזה יחיד, הדו ח על התדר של אירועים אקסוציטוזה, אבל לא מציגות מידע כמותי על השלפוחיות המוגלתיות הפרשה תוכן לפני שחרור נוירוטרנסמיטר וה פיוז’ן שלפוחית החל.
לכן, כדי לקבל הבנה טובה יותר של שלפוחית איך הפרשה בתא הציטופלסמה להגיב חוץ-תאי הלחץ osmotic לפני התא מופעלת בתהליך אקסוציטוזה, שיטות אנליטיות משלימים אחרים יכול לשמש כדי להעשיר את המידע הזה. למשל, כדי לחקור אם הלחץ osmotic הפיצולים נפח שלפוחית, במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים (TEM) הדמיה ניתוח יכול לשמש כדי למדוד את גודל שלפוחית של תאים לאחר קיבוע כימי. כדי לבחון אם osmotic לחץ משפיע על גודל quantal שלפוחית, amperometric פיתחה לאחרונה בטכניקה הקרויה תאיים cytometry אלקטרוכימי, יכול להיות מיושם על כימות של שלפוחית תוכן עצבי ב שלפוחית הפרשה ב שלהם מצב מקורי כאשר בעובדי בציטופלסמה של תאים חיים26. בשיטה תאיים cytometry אלקטרוכימי, אלקטרודה סיב פחמן גלילי nanotip בעדינות מוכנס לתוך הציטופלסמה של תאים חיים, על-ידי החלת +700 mV פוטנציאל אלקטרודה זו (לעומת Ag/AgCl להפנות אלקטרודה), קטכולאמין תכולת שלפוחית ניתן לכמת על ידי הגילוי של יתד הנוכחי חמצון-חיזור של שלפוחית אחת מתנגשים, adsorbing, ולא לאחר מכן stochastically קריעה על פני האלקטרודה, ובכך לשחרר את תוכנם נגד אלקטרודה משטח26. לפיכך, amperometric הנוכחי לעומת זמן מעקב, כל אירוע rupturing שלפוחית יחיד יכול לגרום ארעי הנוכחי ו, בהכניסו את האזור של ספייק הנוכחי כל, הגודל quantal שלפוחית ניתן לחשב באמצעות חוק Faraday´s.
לכן, על-ידי קישור המידע הכמותי שנרכשו מ מדידות גודל שלפוחית באמצעות הדמיה TEM יחד עם שלפוחית בגודל quantal ניתוח, כפי שנרשם על ידי תאיים cytometry אלקטרוכימי, שלפוחית עצבי הריכוז יכול גם להיות נחושים. זה מאפשר שלפוחית אפיון כאשר התאים חשופים למצבים שונים osmotic ומספק תצוגה טובה יותר על איך שלפוחית עשויים להגיב חוץ-תאי הלחץ osmotic בשלב לפני אקסוציטוזה. התוצאות של שילוב שיטות אלה הראו כי בנוכחות לחץ אוסמוטי גבוה חוץ-תאית, שלפוחית להתכווץ ולהתאים את גודלם quantal השוואת מידע כמותי על השינויים היחסיים של מדידות אלה מראה כי תוך כדי כיווץ, שלפוחית להתאים את התוכן ואת גודל כדי לשמור על ריכוז של עצבי קבוע24. לכן, הבנה זו הוא ערך שם מתחבר תצפיותיו על שחרור נוירוטרנסמיטר בתאים שנחשפו ללחץ osmotic. בפרוטוקולים אלה, אנו מתארים את השימוש האלה מתודולוגיות משלימות שלושה המאפשרים אפיון שלפוחית איך הפרשה ב שלהם לסביבתם הטבעית להגיב osmolality חוץ-תאית, את ההשפעות של תגובה זו על אקסוציטוזה תהליך. בנוסף התצפיות הקודמות לגבי ההשפעה של לחץ אוסמוטי גבוה על אקסוציטוזה24, אנו מציגים ניסויים נוספים המתארים תא התאוששות לאחר הלם אוסמוטי ואת השפעת stimulations בריום מרובים ב- chromaffin תאים.
Protocol
Representative Results
Discussion
אנו מציגים כאן פרוטוקול ומהם היתרונות של שילוב שלוש שיטות אנליטיות משלימים לנתח שלפוחית הפרשה ותהליך אקסוציטוזה כדי להשיג הבנה טובה יותר של כיצד כוח פיזי כגון לחץ אוסמוטי יכולות להשפיע על הפרשה שלפוחית בתהליך אקסוציטוזה בתאי הפרשה. שיטות אלה כוללות סיב פחמן microelectrode amperometry, אשר היא שיטה ה?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים רוצה להודות המועצה למחקר השבדי (349-2007-8680) למימון, Dalsjöfors Kött AB (Dalsjöfors, שוודיה) לתרומה של שור בלוטת יותרת הכליה.
Materials
| NaCl | Sigma Aldrich | S7653 | |
| KCl | Sigma Aldrich | P9333 | |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S5761 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
| MgCl2 | Sigma Aldrich | M-2670 | |
| Glucose | Sigma Aldrich | G8270 | |
| Collagenase P | Roche, Sweden | 11 213 857 001 | |
| 100-µM Nylon mesh | Fisher Sientific | 08-771-19 | |
| Percoll | Sigma Aldrich | P1677 | |
| Collagen IV coated 60 mm plastic dish | VWR | 354416 | |
| Centrifuge | Avanti J-20XP | ||
| Borosilicate glass capillary | Sutter instrument Co., Novato, CA | ||
| Micropipette puller | Narishing Inc., Japan | PE-21 | |
| Epoxy solutions (A and B) | Epoxy technology, Billerica, MA | ||
| Beveller | Narishing Inc. | EG-400 | |
| Inverted Microscope | Olympus | IX81 | |
| Patch clamp Instrument | Molecular Devices, Sunnyvale, CA | Axopatch 200B | |
| Micromanipulator | Burleigh Instrument Inc., USA | PCS-5000 | |
| Butane Flame | Multiflame AB, Hässelholm, Sweden | ||
| Transmission electron microscopy | Omega | Leo 912 AB |
References
- Albillos, A., et al. The exocytotic event in chromaffin cells revealed by patch amperometry. Nature. 389 (6650), 509-512 (1997).
- Dunevall, J., et al. Characterizing the Catecholamine Content of Single Mammalian Vesicles by Collision-Adsorption Events at an Electrode. J Am Chem Soc. 137 (13), 4344-4346 (2015).
- Crivellato, E., Nico, B., Ribatti, D. The chromaffin vesicle: advances in understanding the composition of a versatile, multifunctional secretory organelle. Anat Rec. 291 (12), 1587-1602 (2008).
- Morris, S., Schultens, H., Schober, R. An osmometer model for changes in the buoyant density of chromaffin granules. Biophys J. 20 (1), 33 (1977).
- Winkler, H., Smith, A. D. The chromaffin granule and the storage of catecholamines. Handbook of Physiology. 6 (7), 321-399 (1975).
- Phillips, J., Allison, Y., Morris, S. The distribution of calcium, magnesium, copper and iron in the bovine adrenal medulla. Neurosci. 2 (1), 147-152 (1977).
- Estévez-Herrera, J., et al. ATP: The crucial component of secretory vesicles. Proc Natl Acad Sci. 113 (28), 4098-4106 (2016).
- Machado, J. D., Camacho, M., Alvarez, J., Borges, R. On the role of intravesicular calcium in the motion and exocytosis of secretory organelles. Commun integr biol. 2 (2), 71-73 (2009).
- Toll, L., Howard, B. D. Role of Mg2+ ion-activated ATPase and a pH gradient in the storage of catecholamines in synaptic vesicles. 생화학. 17 (13), 2517-2523 (1978).
- Terland, O., Flatmark, T. Ascorbate as a natural constituent of chromaffin granules from the bovine adrenal medulla. FEBS letters. 59 (1), 52-56 (1975).
- Camacho, M., Machado, J. D., Montesinos, M. S., Criado, M., Borges, R. Intragranular pH rapidly modulates exocytosis in adrenal chromaffin cells. J Neurochem. 96 (2), 324-334 (2006).
- Jankowski, J. A., Schroeder, T. J., Ciolkowski, E. L., Wightman, R. M. Temporal characteristics of quantal secretion of catecholamines from adrenal medullary cells. J Biol Chem. 268 (20), 14694-14700 (1993).
- Daniels, A., Williams, R., Wright, P. The character of the stored molecules in chromaffin granules of the adrenal medulla: a nuclear magnetic resonance study. Neurosci. 3 (6), 573-585 (1978).
- Borges, R., Travis, E. R., Hochstetler, S. E., Wightman, R. M. Effects of external osmotic pressure on vesicular secretion from bovine adrenal medullary cells. J Biol Chem. 272 (13), 8325-8331 (1997).
- Troyer, K. P., Mundorf, M. L., Fries, H. E., Wightman, R. Separating vesicle fusion and exocytosis in hypertonic conditions. Ann NY Acad Sci. 971 (1), 251-253 (2002).
- Brodwick, M. S., Curran, M., Edwards, C. Effects of osmotic stress on mast cell vesicles of the beige mouse. J Membrane Biol. 126 (2), 159-169 (1992).
- Amatore, C., Arbault, S., Bonifas, I., Lemaitre, F., Verchier, Y. Vesicular exocytosis under hypotonic conditions shows two distinct populations of dense core vesicles in bovine chromaffin cells. Chem Phys Chem. 8 (4), 578-585 (2007).
- Hampton, R. Y., Holz, R. W. Effects of changes in osmolality on the stability and function of cultured chromaffin cells and the possible role of osmotic forces in exocytosis. J Cell Biol. 96 (4), 1082-1088 (1983).
- Troyer, K. P., Wightman, R. M. Temporal separation of vesicle release from vesicle fusion during exocytosis. J Biol Chem. 277 (32), 29101-29107 (2002).
- Pihel, K., Travis, E. R., Borges, R., Wightman, R. M. Exocytotic release from individual granules exhibits similar properties at mast and chromaffin cells. Biophys J. 71 (3), 1633 (1996).
- Jankowski, J. A., Finnegan, J. M., Wightman, R. M. Extracellular ionic composition alters kinetics of vesicular release of catecholamines and quantal size during exocytosis at adrenal medullary cells. J Neurochem. 63 (5), 1739-1747 (1994).
- Leszczyszyn, D. J., et al. Nicotinic receptor-mediated catecholamine secretion from individual chromaffin cells. Chemical evidence for exocytosis. J Biol Chem. 265 (25), 14736-14737 (1990).
- Wightman, R., et al. Temporally resolved catecholamine spikes correspond to single vesicle release from individual chromaffin cells. P Natl Acad Sci. 88 (23), 10754-10758 (1991).
- Fathali, H., Dunevall, J., Majdi, S., Cans, A. -. S. Extracellular osmotic stress reduces the vesicle size while keeping a constant neurotransmitter concentration. ACS Chemical Neuroscience. , (2017).
- Bath, B. D., et al. Subsecond adsorption and desorption of dopamine at carbon-fiber microelectrodes. Anal Chem. 72 (24), 5994-6002 (2000).
- Li, X., Majdi, S., Dunevall, J., Fathali, H., Ewing, A. G. Quantitative Measurement of Transmitters in Individual Vesicles in the Cytoplasm of Single Cells with Nanotip Electrodes. Angew Chem Int Edit. 54 (41), 11978-11982 (2015).
- Zoski, C. G., Mirkin, M. V. Steady-state limiting currents at finite conical microelectrodes. Anal Chem. 74 (9), 1986-1992 (2002).
- Mosharov, E. V., Sulzer, D. Analysis of exocytotic events recorded by amperometry. Nat Methods. 2 (9), 651-658 (2005).
- Morris, J. K. A formaldehyde glutaraldehyde fixative of high osmolality for use in electron microscopy. J Cell Biol. 27, 137-139 (1965).
- Parsons, T. D., Coorssen, J., Horstmann, H., Almers, W. Docked granules, the exocytic burst, and the need for ATP hydrolysis in endocrine cells. Neuron. 15 (5), 1085-1096 (1995).
