Ozmotik stres etkisi salgı veziküller ve ekzositozu izleme
Summary
Ozmotik stres ekzositozu ve bu işlem sırasında serbest nörotransmitter miktarını etkiler. Biz nasıl transmisyon elektron mikroskobu ile birlikte elektrokimyasal yöntemleri birleştirerek ekstraselüler ozmotik basınç etkisi ekzositozu etkinlik, vezikül quantal boyut ve serbest nörotransmitter miktarı incelemek için kullanılabileceğini göstermek ekzositozu sırasında.
Abstract
Amperometry kayıt hücre salgı hücreleri ekzositozu etkinlik ve veziküller içinde tek ekzositozu olaylar serbest nörotransmitter miktarını azaltarak bu fiziksel stres yanıt ozmotik şok göstermek için tabi. Okuldan nörotransmitter azalma membran biyofiziksel özelliklerinde değişiklikler nedeniyle yanıt ozmotik stres olarak hücreleri küçültmek ve bu varsayımlar ile hücre sitoplazma içinde salgı veziküller etkilenmez olduğunu sürülmüştür hücre dışı ozmotik stres. Amperometry kayıt ekzositozu ne bir vezikül ile plazma zarı Sigortalar ancak vezikül füzyon tetiklenir önce bilgi vezikül içeriğine sağlamaz an hücrelerden serbest izler. Bu nedenle, amperometry birleştirerek ekzositozu hücreler tetiklenir önce salgı veziküller karakterize bir özelliği olan diğer tamamlayıcı analitik yöntemleri ile kayıt nasıl salgı veziküller incelenmesi için daha geniş bir genel bakış sunar ve ekzositozu işlem ozmotik şok tarafından etkilenir. Biz burada nasıl hücre içi elektrokimyasal sitometresi ve transmisyon elektron mikroskobu (TEM) görüntüleme ile kayıt amperometry tamamlayan salgı veziküller boyutu ve nörotransmitter içeriğindeki değişiklikler karakterize etmek için kullanılabileceğini tarif kromafin hücre ekzositozu etkinlik öncesi ve sonrası ozmotik strese maruz kalma ile ilgili olarak. Tüm üç analitik yöntemlerle deneylerden elde edilen nicel bilgilerden bağlayarak, sonuçlar daha önce salgı veziküller içinde boyutunu küçültme ve vezikül quantal boyutunu azaltarak ekstraselüler ozmotik stres yanıt yapılmıştır bir sabit vezikül nörotransmitter konsantrasyon korumak. Bu nedenle, bu neden veziküller, ozmotik stres, cevaben ekzositozu yayın sırasında serbest tutar nörotransmitter azaltmak ile ilgili bir açıklama sağlar. Buraya amperometric recordings tersinir bir süreç ve o vezikül yerleştirilmiş hücreler izotonik bir ortama döndürülür zaman nörotransmiterler ile ozmotik şok doldurulmuş sonra bu gösterir.
Introduction
Böbrek üstü bezlerinde kromafin hücre nörotransmitter molekülleri kan akışı içine yayın nöroendokrin hücrelerdir. Bu bir bağlantı içerir hücresel süreç ve içerik veziküller ekzositozu denen bir süreç ekstrasellüler alana yayın sonuçlanan veziküller, nörotransmitter dolu bir füzyon yoluyla ortaya çıkar. Nörotransmiterler (adrenalin ve noradrenalin) kromafin hücre içinde aktif olarak büyük yoğun çekirdek veziküller (LDCVs) zar proteinleri tarafından taşınan ve yüksek konsantrasyonda (~0.5-1 M)1,2‘ de depolanan. LDCVs içinde nörotransmitter birikimi katekoiamin molekülleri benzeşme chromogranin proteinler (~ 169 mg/mL)3,4,5 oluşan intravesicular yoğun çekirdek protein Matrix sağlanır ,6ve ATP (125-300 mM)7, Ca2 + gibi vezikül içine katekoiamin yükleme ve depolama için anahtar bileşenleri içeren intravesicular bir kokteyl çözüm (50-100 µM çözüm ve ~ 40 mM bağlı protein matriksi)8, Mg2 + (5 mM)9, askorbat (10-30 mM)10ve pH ~5.511,12. Teorik çözünen konsantrasyon veziküller içinde toplamı 750 mm’den kadar rağmen ISO ozmotik bir koşulu ile hücre sitoplazma (310 mOsm/kg)13, LDCVs korumak. İntravesicular bileşenleri bileşimi sadece yoğun çekirdek protein matris için yükleme ve depolama katekolaminler, aynı zamanda solutes toplama işlemi için gerekli değildir. Bu önemli ölçüde azaltır veziküller Osmolarite önemli ölçüde azalır ve ekzositozu5,6sırasında çıkış tutarı katekoiamin etkileyebilir.
Ekstrasellüler ozmotik basınç etkisi ekzositozu işlem amperometric kayıt tarafından çalışmalar o yüksek hücre dışı ozmotik basınç ekzositozu etkinliği engeller ve single’salgılanan nörotransmitter sayısını azaltır bildirdin vezikül bölmeler4,14,15,16,17,18,19. Bu gözlemler açıklamalarını hücre sitoplazma inhibe vezikül füzyon olaylar ve membran biyofiziksel özellikleri sayısını etkileyen bir değişiklik makromoleküllerin kalabalık mümkün geliştirme üzerinde spekülasyonlar var. nörotransmitter ekzositozu sırasında serbest bırakmak. Yüksek hücre dışı ozmotik stres tetiklenmiş ekzositozu14, önceki aşamada bir vezikül bölümünde depolanan nörotransmitter moleküllerin tanımlayan vezikül quantal boyutu etkilemez bu düşünceler kabul 15 , 17 , 19 , 20 , 21. Tek Kişilik hücrelerde ekzositozu açıklaması amperometric ölçümler ile sinaps yapılandırma taklit eden bir deneysel ayarlarý oluşturma hücre yüzeyine yakın temas içinde bir karbon fiber disk elektrot yerleştirilir nereye amperometric elektrot bir postsinaptik dedektörü (şekil 1)22,23hizmet vermektedir. Ekzositozu hücresine uyararak, bir nörotransmitter dolu veziküller hücre plazma zarı ile sigorta ve bölüm veya tam vezikül içerik ekstraselüler uzaya serbest bırakmak için teşvik edebilirsiniz. Nörotransmitter electroactive (örneğin, katekolaminler) Ag/AgCl referans elektrot bir Redoks potansiyeli 700 mV vs uygulayarak Eğer elektrot yüzeyi yayımlanan bu nörotransmitter moleküller mamüllerinin tespit edilebilir . Sonuç olarak, geçerli sivri bir dizi bireysel ekzositozu olayları algılama işaretleyin. Geçerli zaman izleme amperometric kaydında karşı her tek amperometric spike altına alan başına ekzositozu olay tespit ücret temsil eder ve serbest, Faraday denklemi kullanarak nörotransmitter köstebek için dönüştürülebilir. Bu nedenle, amperometric kayıtları tek ekzositozu olaylardan ihraç tutarı nörotransmitter hakkında kantitatif bilgi vermek ve ekzositozu olaylar frekanstan rapor ancak salgı veziküller nicel bilgi mevcut değil içerik vezikül füzyon ve nörotransmitter yayın önce başlatıldı.
Bu nedenle, nasıl salgı veziküller hücrede daha iyi anlaşılmasını almak için sitoplazma yanıt ekstraselüler ozmotik stres için hücre ekzositozu, geçmesi tetiklenir önce bu bilgileri zenginleştirmek için diğer tamamlayıcı analitik yöntemleri kullanılabilir. Örneğin, ozmotik stres sivilce cilt değiştirirse araştırmaya, transmisyon elektron mikroskobu (TEM) analiz görüntüleme sonra kimyasal fiksasyonu hücrelerin vezikül boyutunu ölçmek için kullanılabilir. Ozmotik stres sivilce quantal boyutu etkiliyorsa incelemek için hücre içi elektrokimyasal sitometresi adında bir son zamanlarda geliştirilen amperometric teknik uygulanabilir vezikül nörotransmitter içerik salgı veziküller, miktar için onların hala canlı hücreleri26sitoplazma içinde ikamet ettiği yerel durum. Hücre içi elektrokimyasal sitometresi teknikte nanotip silindirik karbon fiber elektrot yavaşça canlı hücre ve bu elektrot için 700 mV potansiyel uygulayarak sitoplazma içine eklenir (vs bir Ag/AgCl referans elektrot), lanetlendiklerine memnun veziküller içinde çarpışma, adsorbing ve daha sonra stochastically elektrot yüzeyi rüptür ve böylece serbest içeriklerini karşı tek veziküller gelen ani geçerli bir Redoks tespiti tarafından sayılabilir elektrot yüzey26. Bu nedenle, zaman izleme karşı geçerli amperometric, her tek vezikül rupturing olay içinde geçerli bir geçici yol açabilir ve, her geçerli spike alan entegre ederek, vezikül quantal boyutu Faraday´s hukuk kullanılarak hesaplanabilir.
Bu nedenle, hücre içi elektrokimyasal sitometresi tarafından kaydedildiği şekilde TEM görüntüleme vezikül quantal boyut analizi, birlikte kullanarak vezikül boyut ölçüleri elde niceliksel bilgileri bağlayarak, vezikül nörotransmitter konsantrasyonu da olabilir kararlı olmak. Bu hücreler için farklı ozmotik koşullar maruz kaldığında vezikül karakterizasyonu ve nasıl veziküller ekzositozu önce aşamada hücre dışı ozmotik strese yanıt verebilir üzerinde daha iyi bir görünüm sağlar. Bu yöntemler bir araya gelen sonuçları ekstraselüler yüksek ozmotik basınç, huzurunda veziküller küçültmek ve onların quantal boyutu ayarlamak ve bu ölçümler göreli değişikliklerden nicel bilgi karşılaştırarak gösteren göstermiştir çekmek ise, veziküller onların içeriği ve sürekli nörotransmitter konsantrasyon24korumak için boyutunu ayarlamak. Böylece, bu anlayış ozmotik stres maruz hücrelerdeki nörotransmitter sürümü üzerinde yapılan gözlemler bağlanma değerlidir. Bu protokoller ekstraselüler osmolalite kendi yerel ortamını yanıt nasıl salgı veziküller karakterizasyonu ve bu yanıt etkisi ekzositozu izin bu üç tamamlayıcı metodolojileri nasıl kullanılacağını açıklar işlem. Bizim önceki gözlemleri yüksek ozmotik basınç ekzositozu24ek olarak etkisi ile ilgili olarak, biz hücre kurtarma sonra ozmotik şok ve birden çok baryum elektrodlar kromafin içinde etkisini açıklayan ek deneyler mevcut hücreleri.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada bir iletişim kuralı ve salgı veziküller ve daha iyi nasıl bir fiziksel güç gibi ozmotik basınç salgı veziküller etkileyebilir anlayış kazanmak için ekzositozu işlemi çözümlemek için üç tamamlayıcı analitik yöntemleri birleştiren avantajları mevcut ve salgı hücreleri ekzositozu sürecinde. Bu yöntemler ekzositozu etkinlik, veziküller kendi doğal ortamlarında quantal boyutunu belirlemek için kullanılır, hücre içi elektrokimyasal sitometresi kayıt için kurulan bir yöntemdir kar…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar İsveçli Araştırma Konseyi (349-2007-finansman için 8680) ve Dalsjöfors Kött AB (Dalsjöfors, İsveç) sığır adrenal bezleri bağış için teşekkür etmek istiyorum.
Materials
| NaCl | Sigma Aldrich | S7653 | |
| KCl | Sigma Aldrich | P9333 | |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S5761 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
| MgCl2 | Sigma Aldrich | M-2670 | |
| Glucose | Sigma Aldrich | G8270 | |
| Collagenase P | Roche, Sweden | 11 213 857 001 | |
| 100-µM Nylon mesh | Fisher Sientific | 08-771-19 | |
| Percoll | Sigma Aldrich | P1677 | |
| Collagen IV coated 60 mm plastic dish | VWR | 354416 | |
| Centrifuge | Avanti J-20XP | ||
| Borosilicate glass capillary | Sutter instrument Co., Novato, CA | ||
| Micropipette puller | Narishing Inc., Japan | PE-21 | |
| Epoxy solutions (A and B) | Epoxy technology, Billerica, MA | ||
| Beveller | Narishing Inc. | EG-400 | |
| Inverted Microscope | Olympus | IX81 | |
| Patch clamp Instrument | Molecular Devices, Sunnyvale, CA | Axopatch 200B | |
| Micromanipulator | Burleigh Instrument Inc., USA | PCS-5000 | |
| Butane Flame | Multiflame AB, Hässelholm, Sweden | ||
| Transmission electron microscopy | Omega | Leo 912 AB |
References
- Albillos, A., et al. The exocytotic event in chromaffin cells revealed by patch amperometry. Nature. 389 (6650), 509-512 (1997).
- Dunevall, J., et al. Characterizing the Catecholamine Content of Single Mammalian Vesicles by Collision-Adsorption Events at an Electrode. J Am Chem Soc. 137 (13), 4344-4346 (2015).
- Crivellato, E., Nico, B., Ribatti, D. The chromaffin vesicle: advances in understanding the composition of a versatile, multifunctional secretory organelle. Anat Rec. 291 (12), 1587-1602 (2008).
- Morris, S., Schultens, H., Schober, R. An osmometer model for changes in the buoyant density of chromaffin granules. Biophys J. 20 (1), 33 (1977).
- Winkler, H., Smith, A. D. The chromaffin granule and the storage of catecholamines. Handbook of Physiology. 6 (7), 321-399 (1975).
- Phillips, J., Allison, Y., Morris, S. The distribution of calcium, magnesium, copper and iron in the bovine adrenal medulla. Neurosci. 2 (1), 147-152 (1977).
- Estévez-Herrera, J., et al. ATP: The crucial component of secretory vesicles. Proc Natl Acad Sci. 113 (28), 4098-4106 (2016).
- Machado, J. D., Camacho, M., Alvarez, J., Borges, R. On the role of intravesicular calcium in the motion and exocytosis of secretory organelles. Commun integr biol. 2 (2), 71-73 (2009).
- Toll, L., Howard, B. D. Role of Mg2+ ion-activated ATPase and a pH gradient in the storage of catecholamines in synaptic vesicles. 생화학. 17 (13), 2517-2523 (1978).
- Terland, O., Flatmark, T. Ascorbate as a natural constituent of chromaffin granules from the bovine adrenal medulla. FEBS letters. 59 (1), 52-56 (1975).
- Camacho, M., Machado, J. D., Montesinos, M. S., Criado, M., Borges, R. Intragranular pH rapidly modulates exocytosis in adrenal chromaffin cells. J Neurochem. 96 (2), 324-334 (2006).
- Jankowski, J. A., Schroeder, T. J., Ciolkowski, E. L., Wightman, R. M. Temporal characteristics of quantal secretion of catecholamines from adrenal medullary cells. J Biol Chem. 268 (20), 14694-14700 (1993).
- Daniels, A., Williams, R., Wright, P. The character of the stored molecules in chromaffin granules of the adrenal medulla: a nuclear magnetic resonance study. Neurosci. 3 (6), 573-585 (1978).
- Borges, R., Travis, E. R., Hochstetler, S. E., Wightman, R. M. Effects of external osmotic pressure on vesicular secretion from bovine adrenal medullary cells. J Biol Chem. 272 (13), 8325-8331 (1997).
- Troyer, K. P., Mundorf, M. L., Fries, H. E., Wightman, R. Separating vesicle fusion and exocytosis in hypertonic conditions. Ann NY Acad Sci. 971 (1), 251-253 (2002).
- Brodwick, M. S., Curran, M., Edwards, C. Effects of osmotic stress on mast cell vesicles of the beige mouse. J Membrane Biol. 126 (2), 159-169 (1992).
- Amatore, C., Arbault, S., Bonifas, I., Lemaitre, F., Verchier, Y. Vesicular exocytosis under hypotonic conditions shows two distinct populations of dense core vesicles in bovine chromaffin cells. Chem Phys Chem. 8 (4), 578-585 (2007).
- Hampton, R. Y., Holz, R. W. Effects of changes in osmolality on the stability and function of cultured chromaffin cells and the possible role of osmotic forces in exocytosis. J Cell Biol. 96 (4), 1082-1088 (1983).
- Troyer, K. P., Wightman, R. M. Temporal separation of vesicle release from vesicle fusion during exocytosis. J Biol Chem. 277 (32), 29101-29107 (2002).
- Pihel, K., Travis, E. R., Borges, R., Wightman, R. M. Exocytotic release from individual granules exhibits similar properties at mast and chromaffin cells. Biophys J. 71 (3), 1633 (1996).
- Jankowski, J. A., Finnegan, J. M., Wightman, R. M. Extracellular ionic composition alters kinetics of vesicular release of catecholamines and quantal size during exocytosis at adrenal medullary cells. J Neurochem. 63 (5), 1739-1747 (1994).
- Leszczyszyn, D. J., et al. Nicotinic receptor-mediated catecholamine secretion from individual chromaffin cells. Chemical evidence for exocytosis. J Biol Chem. 265 (25), 14736-14737 (1990).
- Wightman, R., et al. Temporally resolved catecholamine spikes correspond to single vesicle release from individual chromaffin cells. P Natl Acad Sci. 88 (23), 10754-10758 (1991).
- Fathali, H., Dunevall, J., Majdi, S., Cans, A. -. S. Extracellular osmotic stress reduces the vesicle size while keeping a constant neurotransmitter concentration. ACS Chemical Neuroscience. , (2017).
- Bath, B. D., et al. Subsecond adsorption and desorption of dopamine at carbon-fiber microelectrodes. Anal Chem. 72 (24), 5994-6002 (2000).
- Li, X., Majdi, S., Dunevall, J., Fathali, H., Ewing, A. G. Quantitative Measurement of Transmitters in Individual Vesicles in the Cytoplasm of Single Cells with Nanotip Electrodes. Angew Chem Int Edit. 54 (41), 11978-11982 (2015).
- Zoski, C. G., Mirkin, M. V. Steady-state limiting currents at finite conical microelectrodes. Anal Chem. 74 (9), 1986-1992 (2002).
- Mosharov, E. V., Sulzer, D. Analysis of exocytotic events recorded by amperometry. Nat Methods. 2 (9), 651-658 (2005).
- Morris, J. K. A formaldehyde glutaraldehyde fixative of high osmolality for use in electron microscopy. J Cell Biol. 27, 137-139 (1965).
- Parsons, T. D., Coorssen, J., Horstmann, H., Almers, W. Docked granules, the exocytic burst, and the need for ATP hydrolysis in endocrine cells. Neuron. 15 (5), 1085-1096 (1995).
