एक उपंयास फीडर इन विट्रो में Murine प्राकृतिक हत्यारा कोशिकाओं के बड़े पैमाने पर उत्पादन के लिए मुफ्त प्रणाली
Summary
यहां, हम इन विट्रो में और vivo मेंयंत्रवत अध्ययन के लिए एक फीडर मुक्त भेदभाव प्रणाली का उपयोग करके बड़े पैमाने पर उत्पादन जीन मुंह murine NK कोशिकाओं के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं ।
Abstract
प्राकृतिक हत्यारा (NK) कोशिकाओं को जन्मजात प्रतिरक्षा प्रणाली के हैं और एक पहली लाइन विरोधी कैंसर प्रतिरक्षा रक्षा कर रहे हैं; हालांकि, वे ट्यूमर microenvironment में दबा रहे है और अंतर्निहित तंत्र अभी भी काफी हद तक अज्ञात है । NK कोशिकाओं के एक सुसंगत और विश्वसनीय स्रोत की कमी NK कोशिका प्रतिरक्षा की अनुसंधान प्रगति को सीमित करता है । यहां, हम एक इन विट्रो प्रणाली है कि उच्च गुणवत्ता और अस्थि मज्जा की मात्रा प्रदान कर सकते है एक फीडर मुक्त हालत के तहत murine NK कोशिकाओं की रिपोर्ट । अधिक महत्वपूर्ण बात, हम यह भी प्रदर्शित करता है कि सिरना-मध्यस्थता जीन मुंह सफलतापूर्वक इस प्रणाली का उपयोग करके E4bp4-निर्भर NK कोशिका परिपक्वता को रोकता है । इस प्रकार, इन विट्रो NK कोशिका विभेदन प्रणाली प्रतिरक्षा अनुसंधान के लिए एक भौतिक समाधान है ।
Introduction
कैंसर की प्रगति काफी हद तक ट्यूमर microenvironment,2सहित, मेजबान-व्युत्पंन immunocytes, जैसे, NK कोशिकाओं पर निर्भर है । कई अध्ययनों से प्रदर्शित किया है कि intratumoral NK कोशिकाओं को नकारात्मक ट्यूमर प्रगति3,4के साथ संबंधित हैं । इसके अलावा, नैदानिक अध्ययनों से पता चला है कि NK कोशिका दत्तक चिकित्सा कैंसर के लिए एक संभव रणनीति5,6,7,8,9। NK कोशिका आधारित कैंसर immunotherapy ठोस ट्यूमर के लिए एक चिकित्सीय विकल्प के रूप में हाल ही में सुझाव दिया गया था, लेकिन चुनौतियां ठोस ट्यूमर के downregulation में लाइगैंडों सक्रिय करने के गुर्दे साइटोकिंस और microenvironment के स्राव के कारण मौजूद 10,11. रूपांतरित विकास कारक-β (TGF-β) कैंसरजनन में एक दमन भूमिका निभाने के लिए सुझाव दिया गया है, लेकिन विडंबना यह है कि कैंसर की कोशिकाओं को भी TGF-β1 ट्यूमर विकास का समर्थन करने के लिए उत्पादन12,13,14 , 15. TGF-β सिगनल नीचे के माध्यम से NK कोशिकाओं के cytolytic गतिविधि को दबा सकते हैं-विनियमन इंटरफेरॉन जवाबदेही और CD16-मध्यस्थता इंटरफेरॉन-गामा (IFN-γ) उत्पादन इन विट्रो16,17, 18.
हालांकि TGF के विघटन-β ट्यूमर microenvironment में संकेत कैंसर को नष्ट करने के लिए एक संभव तरीका हो सकता है, पूरी तरह से अवरुद्ध TGF-β संकेतन इसके विरोधी भड़काऊ समारोह के कारण, के रूप में के विकास के सबूत के रूप में स्व-प्रतिरक्षित रोगों का कारण होगा प्रणालीगत सूजन, हृदय दोष, और प्रतिरक्षा माउस मॉडल19में सहित प्रतिकूल दुष्प्रभावों । इस प्रकार, TGF के कार्य तंत्र को समझना-β-मध्यस्थता प्रतिरक्षादमन कैंसर के इलाज के लिए एक सुलभ चिकित्सीय लक्ष्य की पहचान करने के लिए नेतृत्व करेंगे.
आणविक NK कोशिका विकास के लिए आवश्यक घटनाओं स्पष्ट करने के लिए, विलियंस एट अल. एक इन विट्रो प्रणाली में murine अस्थि मज्जा टेम स्टेम कोशिकाओं को NK कोशिकाओं20में अंतर के लिए स्थापित किया । इस प्रणाली में काफी हद तक NK सेल विकास के यंत्रवत अध्ययन की सुविधा है, जिसमें NK कोशिकाओं के उपन्यास progenitors की पहचान21है. हालांकि, अस्थि मज्जा progenitors प्रणाली में एक फीडर परत20,21के रूप में OP9 stromal कोशिकाओं का समर्थन करने के साथ किया जाना चाहिए, और इस विषम कोशिका आबादी मोटे तौर पर जीन के आगे आवेदन-बाधित उपकरण सीमा (जैसे, सिरना-मध्यस्थता जीन मुंह) विशेष रूप से अंतर NK कोशिकाओं के लिए लागू होता है ।
यहां, हम एक फीडर मुक्त प्रणाली है कि आगे को संशोधित करके विकसित किया गया है का वर्णन इन विट्रो प्रणाली विलियंस एट अल20के । हमारी प्रणाली में, OP9 stromal फीडर कोशिकाओं की आवश्यकता नहीं है, और इसके बजाय OP9 सशर्त माध्यम से इन विट्रो मेंNK कोशिकाओं के भेदभाव को प्रभावित किए बिना प्रयोग किया जाता है, और यह हाल ही में हमें उजागर करने के लिए नेतृत्व कि TGF-β के माध्यम से कैंसर प्रगति को बढ़ावा देने में सक्षम है 22microenvironment ट्यूमर में E4bp4-निर्भर NK कोशिका विकास को दबा. इस उपंयास प्रणाली को सफलतापूर्वक विशिष्ट शर्तों के तहत NK सेल विकास के आणविक तंत्र elucidating के लिए एक पृष्ठभूमि मुक्त विधि प्रदान करता है (जैसे, उच्च TGF-β1, सिरना-मध्यस्थता जीन मुंह, आदि.) इन विट्रो में।
Protocol
Representative Results
Discussion
वर्तमान काम में, हम अस्थि मज्जा के उत्पादन के लिए एक उपंयास विधि वर्णित है-व्युत्पंन murine NK कोशिकाओं में। मूल प्रणाली21,22 में सेल फीडर सफलतापूर्वक OP9 कोशिकाओं के सशर्त माध्यम है, जो…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस अध्ययन के हांगकांग के अनुसंधान अनुदान परिषद द्वारा समर्थित किया गया था (GRF ४६८५१३, CUHK3/CRF/12R) और हांगकांग के नवाचार और प्रौद्योगिकी कोष (इसके/227/15, इसके InP/164/16, इसके-InP/242/16), अनुसंधान के लिए प्रत्यक्ष अनुदान-CUHK (२०१६.०३५), और हांगकांग के विद्वान कार्यक्रम.
एच.-Y.L. डिजाइन और सभी प्रयोगों की निगरानी और पांडुलिपि तैयारी में योगदान दिया । बजे-K.T. प्रयोगों का प्रदर्शन किया, डेटा का विश्लेषण और पांडुलिपि तैयारी में योगदान दिया । पीसी-टी. टी., J.Y.-एफसीए, जे-सी., एच., क्यू.-M.W., और जी.-Y.L. ने पशु नमूने एकत्र किए और पशु प्रयोगों में भाग लिया. जे, X.-R.H., और K.-F.T. पांडुलिपि तैयारी में योगदान दिया ।
Materials
| OP9 cell line | ATCC | ATCC® CRL-2749™ | |
| MEM α, no nucleosides | Gibco | 22561021 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10500064 | |
| PBS, pH 7.4 | Gibco | 10010049 | |
| Recombinant Murine IL-7 | PEPROTECH | 217-17 | |
| Recombinant Murine SCF | PEPROTECH | 250-03 | |
| Recombinant Murine Flt3-Ligand | PEPROTECH | 250-31L | |
| Recombinant Murine IL-2 | PEPROTECH | 212-12 | |
| Lipofectamin RNAiMAX Transfection Reagent | Invitrogen | 1377815 | |
| IC Fixation Buffer | eBioscience | 00-8222-49 | |
| Flow Cytometry Staining Buffer | eBioscience | 00-4222-26 | |
| PE-conjugated anti-mouse CD244 | eBioscience | 12-2441-83 | |
| Cy3-conjugated anti-mouse NKp46 | Bioss | bs-2417R-cy3 | |
| Nonsense control (NC) | Ribobio | siN05815122147 | |
| siRNA against mouse E4BP4 mRNA | Ribobio | N/A | 5′-GAUGAGGGUGUA GUGGGCAAGUCUU-3′ |
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