Um novo sistema alimentador-livre para produção em massa de murino Natural Killer Cells In Vitro
Summary
Aqui, apresentamos um protocolo para produzir em massa-silenciamento murino células NK usando um sistema de diferenciação de alimentador-livre para estudo mecanicista em vitro e em vivo.
Abstract
Natural killer (NK) células pertencem ao sistema imunitário inato e são uma primeira linha de defesa imunológica contra o cancro; no entanto, eles são suprimidos no microambiente do tumor e o mecanismo subjacente ainda é desconhecido. A falta de uma fonte confiável e consistente de células NK limita o progresso da investigação da imunidade de célula NK. Aqui, nós relatamos um sistema em vitro que pode fornecer alta qualidade e quantidade de medula óssea-derivado murino células NK sob uma condição livre de alimentador. Mais importante, demonstramos também que com êxito silenciamento de genes mediada por siRNA inibe a maturação de células NK E4bp4 dependentes usando este sistema. Assim, esta célula NK romance em vitro diferenciar o sistema é uma solução de biomaterial para pesquisa de imunidade.
Introduction
Progressão de câncer é largamente dependente do tumor microambiente1,2, incluindo o anfitrião-derivado de immunocytes, por exemplo, as células NK. Vários estudos demonstraram que as células NK intratumoral são negativamente correlacionadas com a progressão de tumor3,4. Além disso, estudos clínicos mostraram que a terapia com células NK adotiva é uma estratégia possível para câncer5,6,7,8,9. Imunoterapia baseada em célula NK recentemente foi sugerida como uma opção terapêutica para tumores sólidos, mas os desafios Existem devido a secreção de citocinas imunossupressoras e downregulation de ativação de ligantes no microambiente de tumores sólidos 10,11. Transformar o fator de crescimento-β (TGF-β) tem sido sugerido um papel na carcinogênese supressiva, mas paradoxalmente as células cancerosas também produzem TGF-β1 para apoiar o tumor desenvolvimento12,13,14 , 15. sinalização do TGF-β pode suprimir a atividade citolítica de células NK via receptividade de interferon para baixo-regulação e mediada por CD16 interferon-gama (IFN-γ) produção em vitro16,17, 18.
Apesar de interrupção de TGF-β sinalização no microambiente do tumor pode ser um caminho possível para eliminar cânceres, bloquear completamente a sinalização do TGF-β causará doenças autoimunes, devido à sua função de anti-inflamatórios, como evidenciado pela evolução da efeitos colaterais adversos incluindo inflamação sistêmica, defeitos cardiovasculares e auto-imunidade mouse modelos19. Assim, entender o mecanismo de trabalho de TGF-β-mediada imunossupressão conduzirá à identificação de um alvo terapêutico acessível para tratamento de câncer.
Para elucidar os eventos moleculares necessários para o desenvolvimento de células NK, Williams et al estabeleceu um sistema in vitro para diferenciar as células-tronco hematopoiéticas murino de medula óssea em NK células20. Este sistema facilita em grande parte o estudo mecanicista do desenvolvimento de célula NK, incluindo a identificação dos progenitores romance de NK células21. No entanto, os progenitores da medula óssea devem ser cultivados no sistema com células estromais OP9 de apoio como um alimentador camada20,21, e esta população celular heterogênea em grande parte limita a aplicação adicional de desregulação gene ferramentas (p. ex., silenciamento de genes mediada por siRNA) especificamente aplicada às células NK diferenciadoras.
Aqui, descrevemos um sistema alimentador-livre que se desenvolveu ainda mais, modificando o sistema in vitro de Williams et al.20. Em nosso sistema, as células de alimentador estromais OP9 não são necessárias, e em vez disso OP9 médio condicional é usado sem afetar a diferenciação da NK células in vitroe isto recentemente nos levam a descobrir que o TGF-β é capaz de promover a progressão do câncer através de suprimir o desenvolvimento de células NK E4bp4-dependente no tumor microambiente22. Este novo sistema com sucesso fornece um método livre de plano de fundo para elucidar o mecanismo molecular do desenvolvimento de células NK em condições específicas (por exemplo, elevada TGF-β1, silenciamento de genes mediada por siRNA, etc.) em vitro.
Protocol
Representative Results
Discussion
No presente trabalho, descrevemos um método novo para produzir derivados de medula óssea murino NK células in vitro. O alimentador de célula no sistema original21,22 é substituído com sucesso pelo meio condicional de células OP9, que em grande parte, aumentou a estabilidade do sistema de diferenciação. Além disso, o sistema pode produzir quantidade elevada, e a pureza da NK maduro células para em vitro , bem como na vivo ensa…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudo foi suportado pelo Research Grants Conselho de Hong Kong (GRF-468513, CUHK3/CRF/12R) e inovação e tecnologia Fund de Hong Kong (ITS/227/15, ITS InP/164/16, ITS-InP/242/16), subvenção directa para pesquisa-CUHK (2016.035) e estudioso de Hong Kong Programa.
H.-Y.L. projetado e supervisionou todas as experiências e contribuiu para a preparação do manuscrito. P.M.-K.T. realizou experimentos, analisaram dados e contribuiu para a preparação do manuscrito. PC-T. T., JY-F.C., J.S.-C., H., p.-M.W., e G.-Y.L. coletou amostras de animais e participou de experiências em animais. J.S., X.-R.H., e K.-F.T. contribuiu para a preparação do manuscrito.
Materials
| OP9 cell line | ATCC | ATCC® CRL-2749™ | |
| MEM α, no nucleosides | Gibco | 22561021 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10500064 | |
| PBS, pH 7.4 | Gibco | 10010049 | |
| Recombinant Murine IL-7 | PEPROTECH | 217-17 | |
| Recombinant Murine SCF | PEPROTECH | 250-03 | |
| Recombinant Murine Flt3-Ligand | PEPROTECH | 250-31L | |
| Recombinant Murine IL-2 | PEPROTECH | 212-12 | |
| Lipofectamin RNAiMAX Transfection Reagent | Invitrogen | 1377815 | |
| IC Fixation Buffer | eBioscience | 00-8222-49 | |
| Flow Cytometry Staining Buffer | eBioscience | 00-4222-26 | |
| PE-conjugated anti-mouse CD244 | eBioscience | 12-2441-83 | |
| Cy3-conjugated anti-mouse NKp46 | Bioss | bs-2417R-cy3 | |
| Nonsense control (NC) | Ribobio | siN05815122147 | |
| siRNA against mouse E4BP4 mRNA | Ribobio | N/A | 5′-GAUGAGGGUGUA GUGGGCAAGUCUU-3′ |
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