Summary
여기, 선물이 murine NK 세포 유전자 침묵 시키기 기계 연구 생체 외 및 생체 내에서피더 무료 차별화 시스템을 사용 하 여 대량 생산 하는 프로토콜.
Abstract
자연적인 살인자 (NK) 세포는 타고 난 면역 계통에 속해 있으며 첫 번째 라인 항 암 면역 방어; 그러나, 그들은 종양 microenvironment에서 억제 되 고 기본 메커니즘은 아직 크게 알려진. NK 세포의 일관 되 고 신뢰할 수 있는 소스의 부족 NK 세포 면역의 연구 진행을 제한합니다. 여기, 우리가 시험관에서 시스템 높은 품질과 급지대 무료 조건 murine NK 세포 골 수 유래의 수량을 제공할 수 있는 보고 합니다. 더 중요 한 것은, 우리는 또한 그 중재 하는 siRNA 유전자 침묵이 시스템을 사용 하 여 E4bp4 종속 NK 세포 성숙 억제 성공적으로 보여 줍니다. 따라서,이 소설 체 외에서 NK 세포 분화 시스템 면역 연구를 위한 소재 솔루션입니다.
Introduction
암 진행은 종양 microenvironment1,2, 호스트에서 파생 된 immunocytes, 예를 들면, NK 세포에 크게 의존 합니다. 여러 학문의 intratumoral NK 세포는 종양 진행3,4부정적인 상관 관계를 설명 했다. 또한, 임상 연구 보여주었다 NK 세포 입양 치료 암5,6,7,,89에 대 한 가능한 전략 이다. NK 세포 기반 암 immunotherapy 최근 단단한 종양을 위한 치료 선택권으로 제안 되었다 하지만 면역 억제 cytokines의 분 비와 고체 종양 의 microenvironment에 ligands 활성화 downregulation 존재 하는 과제 10,11. 변형 시키는 성장 인자-β (TGF-β) 발암에 진압 역할을 제안 하고있다 하지만 역설적으로 암 세포는 또한 TGF-β1 종양 개발12,,1314 를 지원 하기 위해 생산 , 15. 인터페론 응답 다운 규제 및 CD16-중재 인터페론-감마 (IFN-γ) 생산 체 외에서16,17를 통해 NK 세포의 cytolytic 활동을 억제 수 있습니다 TGF-β 신호 18.
TGF-β 신호 종양 microenvironment에의 중단 될 수 있지만 암 제거 가능한 방법, 완전히 TGF-β 신호를 차단 하면 항 염증 기능을 인해 자가 면역 질환의 개발에 의해 입증 부작용 등 조직의 염증, 심장 결함, 그리고 마우스에 면역19모델. 따라서, TGF-β-중재 면역 억제의 작동 메커니즘을 이해 이어질 것입니다 암 치료에 대 한 접근 치료 대상의 식별.
NK 세포 개발에 필요한 분자 이벤트 명료 하 윌리엄스 외 20세포 NK로 murine 골 수 조 혈 줄기 세포 분화에 대 한 생체 외에서 시스템 설립. 이 시스템은 크게 NK 세포21의 소설 창시자의 식별을 포함 하 여 NK 세포 개발의 기계 론 적인 연구를 촉진 한다. 그러나, 골 수 창시자로 피더 레이어20,21, OP9 stromal 세포를 지 원하는 시스템에서 경작 한다 그리고이 다른 유형의 세포 인구는 주로 유전자 방해의 추가 응용 프로그램 제한 도구 (예를 들어, 중재 하는 siRNA 유전자 침묵) 차별화 NK 세포에 구체적으로 적용.
여기, 우리 더 윌리엄스 외20의 생체 외에서 시스템을 수정 하 여 개발 된 피더 무료 시스템을 설명 합니다. 우리의 시스템에 OP9 stromal 피더 세포는 필요 하 고 대신 조건부 매체 최근 NK 세포에 생체 외에서그리고이의 차별화를 영향을 주지 않고 사용 OP9 TGF-β는 암 진행을 통해 홍보할 수 밝히기 위해서 우리를 끌 종양 microenvironment22에 E4bp4 종속 NK 세포 개발 억제 이 새로운 시스템 성공적으로 elucidating 특정 조건 하에서 NK 세포 개발의 분자 메커니즘에 대 한 배경 없는 메서드를 제공 합니다 (예를 들어, 높은 TGF-β1, 중재 하는 siRNA 유전자 침묵, 등.) 생체 외에서.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
프로토콜 및 골 수 유래 NK 분화 세포 (BM-NK)에 대 한 이전 게시 방법20,,2122에 기반. 쥐와 모든 절차는 여는 동물 윤리 실험 위원회 (AEEC) 홍콩의 중국 대학에 승인 되었습니다.
1입니다. 준비 OP9 조건부 매체의
- 알파-MEM 20 %FBS, 100 U/mL 페니실린 G 및 공기/CO2 의 습도 분위기에서 37 ° C에서 100 µ g/mL 스 murine 기질 세포 라인 OP9 문화 (95%: 5%).
- Hemocytometer, 다음 씨앗 2 x 106 OP9 각 75 cm2 문화 플라스 크에 세포의 중간의 15 mL와 함께 셀을 계산 합니다. 48 h에 대 한 문화입니다.
- 문화에는 80% 합류에 도달 하면, PBS의 10 mL로 플라스 크를 씻고 고 플라스 크 당 (FBS와 항생제) 없이 일반 알파 가상 매체의 20 mL를 추가 합니다.
- 24 h 문화 플라스 크에서 OP9 조건 매체를 수집 하 고 0.25 µ m polyethersulfone (PES) 필터 셀 파편 청소 4 ° C (사용 2 주 이내)에서 보존.
2입니다. 마우스 골 수 세포의 고립
- Pentobarbitone 과다 (100 mg/kg, 복 주사)와 함께 12 주 된 C57BL/6J 마우스 안락사 호흡의 부족에 의해 죽음을 확인 다음 뼈 사이 접속점에 수술 칼 커팅으로 대 퇴 골 뼈를 수확 하 고 부드러운 긁 적 하 여 블레이드와 나머지 근육을 제거 합니다.
- 냉장된 멸 균 알파-MEM를 포함 하는 50 mL 원심 분리기 튜브에 뼈를 놓고 biosafety 내각에서 다음 단계를 수행 합니다.
- 알파-MEM 매체를 삭제 하 고 30 대 70% 에탄올과 뼈를 씻어 s.
- 두 번을 나머지 에탄올 차가운 살 균 PBS 가진 뼈를 씻어.
- 얼음 처럼 차가운 PBS의 5 mL를 포함 하는 박격포에서 뼈를 전송 하 고는 유 봉과 뼈를 부드럽게 fragmentize (할 하지 격파 그들).
- 교 반 하십시오 뼈 부드럽게 골 수 세포는 PBS에 풀어 유 봉 소용돌이 의해. 새로운 50 mL 원심 분리기 튜브로 PBS 포함 하 골 수 세포를 수집 합니다.
- 뼈 조각 단단한 흰색 색상에 될 때까지 4 번 2.6에 대 한 단계를 반복 합니다.
- 465 x g 4 ° C에서 5 분 동안에 관을 원심 다음 삭제는 상쾌한.
- 18 mL의 멸 균 증류수와 펠 릿을 resuspend 하 고 그것은 30 서 적혈구를 제거 하는 s.
- 얼음 처럼 차가운 10의 2 개 mL를 추가 X PBS는 반응 중지 하는 다음 lysed 적혈구를 제거 하려면 70 µ m 셀 스 트레이너를 통해 혼합물을 필터링.
- 465 x g 4 ° c.에서 5 분 동안에 관을 원심 얼음 처럼 차가운 PBS의 20 mL와 펠 릿 resuspend
- 2.11 단계를 두 번 반복 하 여 세포를 씻어.
- 100 m m 멸 균 페 트리 접시에 단계의 1.2 OP9 조건부 매체의 10 mL와 20로 보충 셀 펠 릿을 전송 %FBS 0.5 ng/mL의 혼합물 murine 일리노이-7, 30 ng/mL 마우스 SCF와 100 U/mL murine flt3L.
- 품 어 2 h. 전송에 대 한 5% CO2 와 37 ° C에서 접시 첨부 되지 않은 셀 5 x 105 가능한 셀/mL (trypan 블루 제외과 hemocytometer 여 수 세포)의 밀도에 새로운 문화 컨테이너로 단계 2.13 에서처럼 동일한 중간 수식 5% CO2와 37 ° C에서 품 어와.
- 하루에 4, 변경 OP9 조건부 매체 문화 상태 20 %FBS 및 2000 U/mL murine 일리노이-2의 보충.
- 새로 문화 매체 매 3 일; NK 세포로 성숙 7 일 여 하 고 섹션 4에서 자격을 갖춘 수 있습니다.
3. NK 세포 분화의 유전자 Silencing siRNA 중재
- 제품 설명서에 따라 transfection 에이전트와 siRNA 또는 넌센스 제어 (NC) 공기로
- 0부터 시간 언제 든 지 3.1 단계를 수행 합니다.
- 추가 50 nM siRNA 또는 단계 2.14에서에서 셀에 NC 혼합물의.
- 실험 끝 지점까지 모든 중간 다과 (예를 들어, 0, 4, 및 7 일)에 3.1 단계를 반복 합니다.
4. NK 세포 분화 Cytometry 사용의 분석
- 적절 한 시간에서 세포 분화의 정지를 수집 하 고 얼음 처럼 차가운 PBS로 세척.
- 제품 설명서에 따라 셀 고정 버퍼와 셀을 수정 합니다.
- 얼음 처럼 차가운 PBS 가진 고정된 셀을 세척 하 고 resuspend Flow Cytometry 얼룩 버퍼 포함 Cy3 활용 된 반대로 마우스 NKp46의 100 µ L에 1 x 106 셀과 1: 100 희석 비율에 반대로 마우스 CD244 항 체 PE 활용.
- 샘플 2 h에 대 한 실 온에서 어둠 속에 얼룩.
- Resuspend, PBS의 300 µ L로 얼룩진된 샘플 다음 FACS 데이터 및 Cytobank 플랫폼20 (http://cytobank.org/)와 분석.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
대표 결과 설명된 프로토콜에 따라 얻을 수 있습니다. 총 골 현 탁 액 셀 피더 무료 차별화 시스템에서 11 일; 재배 했다 확산 속도에 상당한 증가 하루 7 일 0 (그림 1A)에 총 셀 개수와 비교 하 여 관찰 되었다. 높은 세포질에 핵 비율 및과 립 풍부한 세포질 형태학 NK 세포로 성숙 시스템 (그림 1B)에서 6 일에 의해 발견 됐다.
TGF-β1/Smad3 신호 NK 세포 분화, 세포 E4bp4 mRNA (siE4bp4, 그림 2와 같이 E4bp4 mRNA 레벨을 효과적으로 억제) 또는 말도 안 되는 siRNA와 페 했다 골 수에서에서의 규제 효과 명료 하 게 하기 위해 0 일과 하루 4 급지대 셀에서 무료 시스템에 제어 합니다. 차별화 셀 또는 Smad3 억제제 SIS3 없이 시스템에 6 일에 대 한 교양 했다. 흐름 분석 감지의 그 최저 E4bp4는 주로 NK 세포 성숙 같이 감소에 의해 CD244+ ve NKp46-ve 미숙한 NK 세포 NC 페 컨트롤과 비교 반면 TGF-β1/Smad3 활성화의 저해를 억제 siE4BP4 페 그룹 (그림 3)와 비교 하는 NK 세포 성숙의 siRNA 중재 억제를 구출 하는 크게는.
그림 1 . 골 수 유래 NK의 이미지 셀 피더-무료 시스템에서. (A) 성장 곡선의 골까지 하루 11, 셀 계산 하 여 얻은 시스템 겪고 NK 세포 분화 세포. (B) 화살표에 표시 된 대로 높은 세포질에 핵 비율 및과 립 풍부한 세포질 형태학 성숙한 NK 세포 주 6,으로 표시. 확대 200 x, 스케일 바 50 µ m. 데이터 대표 평균 ± SEM 3 독립적인 실험 * * *p < 0.01. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 . 골 수에 중재 하는 siRNA 유전자 침묵의 효과 세포 주 6에 겪고 NK 세포 분화. 차별화 셀 말도 제어 (NC) 또는 0 일과 4 일에 murine E4bp4 mRNA (siE4bp4)을 대상으로 siRNA 페 했다. 실시간 PCR 보여줍니다 mRNA 식 수준 E4bp4 당일 NC 그룹에 비해 6 시-E4bp4 치료 NK 세포에 크게 감소 되었다. 데이터 표현, 3 독립적인 실험에 대 한 평균 ± SEM * *p < 0.05. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 . E4bp4의 입을 TGF-β1/Smad3-종속 방식에서 murine 골 수 유래 NK 세포의 분화를 억제 한다. (A) 교류 cytometry 분석 결과의 그 최저 E4bp4 크게 급지대 무료 시스템 체 외를 사용 하 여 말도 제어 (NC) 그룹에 비해 6 일에 미 숙 (CD244+ ve NKp46-ve) NK 세포의 생산을 감소 , 어떤 Smad3 억제 물 SIS3의 1 개의 µ M와 TGF-β1/Smad3 활성화를 억제 하 여 크게 구출 될 수 있다. (B) 흐름 분석 결과의 정량화 * * *p < 0.01 NC;와 비교 ### p < 0.01 siE4BP4 페 그룹과 비교. 3 독립적인 실험의 대표적인 데이터 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
보충 그림 1입니다. NK 세포 마커 표현의 총 차별화 흐름 분석에 하루 6 셀에 대 한 전략을 게이팅. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
현재 작업에서 우리는 murine NK 세포 골 수 파생 에 시험관을 생산 하는 새로운 방법을 설명 했습니다. 원래 시스템21,22 에 셀 피더 성공적으로 크게 차별화 시스템의 안정성을 증가 OP9 셀의 조건부 매체에 의해 대체 됩니다. 또한, 시스템 높은 수량을 생산할 수 있는 고 순도 성숙한 NK의 세포 생체 외에서 뿐 아니라 대 한 vivo에서 분석 실험, 인간 질병에 있는 NK 세포의 변환 연구 뿐만 아니라 기계 연구를 촉진할 수 있다.
설명된 방법 TGF-β1 NK 세포 억제 암 개발23동안에 신호의 규제 역할을 조사를 위해 사용 되었습니다. 피더 세포에서 아무런 영향을 확인 하 고는, 억제제 중재 억제 뿐 아니라 중재 하는 siRNA 유전자 최저 효율 크게 개선 되었습니다. 급지대 셀 OP9 부재 E4BP4 중재 NK 세포 개발에서 Smad3의 생물 학적 기능 최저 또는 대상 유전자 생체 외에서23의 금지 표시 하 여 보여 수 있습니다.
더 중요 한 것은,이 시스템 비보에 분석 실험에 대 한 유전자 변형된 murine NK 세포의 대량 생산을 위한 더 활용할 수 있습니다. 예를 들어 우리는이 시스템에 의해 적어도 1 x 108 성숙한 NK 세포는 단일 마우스의 골 수 세포에서 생산 하 고 특정 유전자의 최저와 NK 세포 종양-베어링 끄 덕/SCID 마우스 모델에서 차이 보여 주기 위해로 주입 했다 암-죽이 효과 vivo에서23. 실제로, 중재 바이러스 유전자 overexpression, 셀 얼룩, 등이 시스템에 다른 수정 NK 세포에 할 수 있습니다.
그러나, 그 성숙한 NK 세포의 최대 70% 생성 될 수 있다 (데이터 표시 되지 않음), 9 일에 시스템에서 비슷한 OP9 stromal 윌리엄스 외에 의해 표시 된 경작된 시스템의 결과를 주목 한다. 21 이 한계를 극복 하기 위해 혼합된 NK 세포 수 수 추가 정화 흐름 원하는 인구를 분리 하기 위하여 상업 NK 세포 격리 키트로 서 기계, 정렬.
결론적으로, murine 골 수 세포에서 NK 세포를 분화 하는 새로운 방법은 개발 했다. 이 새로운 시스템은 고 순도 및 인간 질병에 면역의 연구에 대 한 NK 세포로 성숙의 수량에 대 한 옵션을 제공할 수 있습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 연구는 연구-CUHK (2016.035), 및 홍콩 학자에 대 한 연구 보조금 위원회의 홍콩 (GRF 468513, CUHK3/CRF/12R) 및 혁신 및 기술 기금의 홍콩 (ITS/227/15, ITS InP/164/16, ITS-InP/242/16), 직접 보조금에 의해 지원 되었다 프로그램입니다.
H. Y.L. 설계 및 모든 실험을 감독 및 원고 준비에 기여. 오후-K.T. 실험 수행, 데이터 분석 및 원고 준비에 기여. 시공-T. 토니, 재-F.C., M.W.-대표-C., 반장 님, 질문, 및 G. Y.L. 동물 샘플을 수집 하 고 동물 실험에 참가 했다. 제, 엑스-상대습도, K. 무정 지형 원고 준비에 기여.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| OP9 cell line | ATCC | ATCC® CRL-2749™ | |
| MEM α, no nucleosides | Gibco | 22561021 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10500064 | |
| PBS, pH 7.4 | Gibco | 10010049 | |
| Recombinant Murine IL-7 | PEPROTECH | 217-17 | |
| Recombinant Murine SCF | PEPROTECH | 250-03 | |
| Recombinant Murine Flt3-Ligand | PEPROTECH | 250-31L | |
| Recombinant Murine IL-2 | PEPROTECH | 212-12 | |
| Lipofectamin RNAiMAX Transfection Reagent | Invitrogen | 1377815 | |
| IC Fixation Buffer | eBioscience | 00-8222-49 | |
| Flow Cytometry Staining Buffer | eBioscience | 00-4222-26 | |
| PE-conjugated anti-mouse CD244 | eBioscience | 12-2441-83 | |
| Cy3-conjugated anti-mouse NKp46 | Bioss | bs-2417R-cy3 | |
| Nonsense control (NC) | Ribobio | siN05815122147 | |
| siRNA against mouse E4BP4 mRNA | Ribobio | N/A | 5′-GAUGAGGGUGUA GUGGGCAAGUCUU-3′ |
References
- Schreiber, R. D., Old, L. J., Smyth, M. J. Cancer immunoediting: integrating immunity's roles in cancer suppression and promotion. Science. 331 (6024), 1565-1570 (2011).
- Junttila, M. R., de Sauvage, F. J. Influence of tumour micro-environment heterogeneity on therapeutic response. Nature. 501 (7467), 346-354 (2013).
- Rusakiewicz, S., et al. Immune infiltrates are prognostic factors in localized gastrointestinal stromal tumors. Cancer Res. 73 (12), 3499-3510 (2013).
- Mamessier, E., et al. Human breast cancer cells enhance self tolerance by promoting evasion from NK cell antitumor immunity. J Clin Invest. 121 (9), 3609-3622 (2011).
- Stern, M., et al. Pre-emptive immunotherapy with purified natural killer cells after haploidentical SCT: a prospective phase II study in two centers. Bone Marrow Transplant. 48 (3), 433-438 (2013).
- Miller, J. S., et al. Successful adoptive transfer and in vivo expansion of human haploidentical NK cells in patients with cancer. Blood. 105 (8), 3051-3057 (2005).
- Rubnitz, J. E., et al. NKAML: a pilot study to determine the safety and feasibility of haploidentical natural killer cell transplantation in childhood acute myeloid leukemia. J Clin Oncol. 28 (6), 955-959 (2010).
- Curti, A., et al. Successful transfer of alloreactive haploidentical KIR ligand-mismatched natural killer cells after infusion in elderly high risk acute myeloid leukemia patients. Blood. 118 (12), 3273-3279 (2011).
- Bachanova, V., et al. Clearance of acute myeloid leukemia by haploidentical natural killer cells is improved using IL-2 diphtheria toxin fusion protein. Blood. 123 (25), 3855-3863 (2014).
- Stringaris, K., et al. Leukemia-induced phenotypic and functional defects in natural killer cells predict failure to achieve remission in acute myeloid leukemia. Haematologica. 99 (5), 836-847 (2014).
- Rouce, R. H., et al. The TGF-β/SMAD pathway is an important mechanism for NK cell immune evasion in childhood B-acute lymphoblastic leukemia. Leukemia. 30 (4), 800-811 (2016).
- Derynck, R., Akhurst, R. J., Balmain, A. TGF-β signaling in tumor suppression and cancer progression. Nature Genet. 29 (2), 117-129 (2001).
- Massague, J. TGFbeta in cancer. Cell. 134 (2), 215-230 (2008).
- Ikushima, H., Miyazono, K. TGFbeta signalling: a complex web in cancer progression. Nat Rev Cancer. 10 (6), 415-424 (2010).
- Pickup, M., Novitskiy, S., Moses, H. L. The roles of TGFβ in the tumour microenvironment. Nat Rev Cancer. 13 (11), 788-799 (2013).
- Rook, A. H., et al. Effects of transforming growth factor beta on the functions of natural killer cells: depressed cytolytic activity and blunting of interferon responsiveness. J Immunol. 136 (10), 3916-3920 (1986).
- Bellone, G., Aste-Amezaga, M., Trinchieri, G., Rodeck, U. Regulation of NK cell functions by TGF-beta 1. J Immunol. 155 (3), 1066-1073 (1995).
- Trotta, R., et al. TGF-β utilizes SMAD3 to inhibit CD16-mediated IFN-γ production and antibody-dependent cellular cytotoxicity in human NK cells. J Immunol. 181 (6), 3784-3792 (2008).
- Shull, M. M., et al. Targeted disruption of the mouse transforming growth factor-β1 gene results in multifocal inflammatory disease. Nature. 359 (6397), 693-699 (1992).
- Chen, T. J., Kotecha, N. Cytobank: providing an analytics platform for community cytometry data analysis and collaboration. Curr Top Microbiol Immunol. 377, 127-157 (2014).
- Williams, N. S., et al. Differentiation of NK1.1+, Ly49+ NK cells from flt3+ multipotent marrow progenitor cells. J Immunol. 163 (5), 2648-2656 (1999).
- Fathman, J. W., et al. Identification of the earliest natural killer cell-committed progenitor in murine bone marrow. Blood. 118 (20), 5439-5447 (2011).
- Tang, P. M., et al. Smad3 promotes cancer progression by inhibiting E4BP4-mediated NK cell development. Nat Commun. 6 (8), 14677 (2017).
