Summary
ここでは、解明in vitroとin vivoの分化のフィーダー フリー システムを使用して、マウスの NK 細胞の遺伝子サイレンシングを量産するためのプロトコルを提案する.
Abstract
ナチュラル キラー (NK) 細胞は自然免疫系に属する、ファーストラインの抗がん免疫の防衛;腫瘍微小環境における抑制し、基になるメカニズムはまだあまり知られていません。NK 細胞の一貫性と信頼性の高いソースの欠如は、NK 細胞免疫の研究の進捗状況を制限します。フィーダー無料条件下でマウスの NK 細胞の骨髄由来の高い質と量を提供できる生体外でシステムを報告する.もっと重要なことは、また、このシステムを使用して正常に E4bp4 依存性 NK 細胞の成熟を阻害 siRNA による遺伝子サイレンシングを示します。したがって、この新規培養NK 細胞システムの差別化は、免疫研究のための生体材料ソリューションです。
Introduction
癌の進行、腫瘍微小環境1、2、宿主由来の免疫細胞、例えば、NK 細胞などに大きく依存します。いくつかの研究は、腫瘍内 NK 細胞は腫瘍進行3,4と負の相関を示した。さらに、臨床研究は、NK 細胞養子療法ががん5,6,7,8,9のための可能な戦略であることを示した。NK 細胞を用いたがん免疫療法は最近固形腫瘍に対する治療の選択肢として提案したが、免疫サイトカインの分泌と固形腫瘍の微小環境における配位子のアクティブ化のための課題が存在10,11。変換増殖因子 β (TGF-β) 細胞がん化の抑制の役割を果たすことが示唆されているが逆説的に癌細胞はまた腫瘍開発12,13,14をサポートする TGF-β 1 を生成,15. インターフェロン応答性の制御を介した CD16 インターフェロン γ (IFN-γ) 生産の in vitro16,17、NK 細胞の細胞障害活性を抑制することができます TGF-β シグナル 18。
腫瘍微小環境における TGF-β シグナルの混乱は、がんを除去するための可能な方法もありますが、完全に TGF-β シグナルをブロックになります、その抗炎症機能による自己免疫疾患の開発によって証明されるよう副作用全身性炎症を含む、心血管の欠陥や自己免疫マウスで19をモデル化します。したがって、TGF β を介した免疫抑制の動作メカニズムを理解することは、ガン治療のためのアクセス可能な治療上のターゲットの同定に します。
NK 細胞の発達に必要な分子のイベントを明らかにするには、ウィリアムズらは20NK へ骨髄造血幹細胞と分化細胞の培養システムを確立しました。このシステム主として NK 細胞、NK 細胞21の新規前駆体の同定を含む機構の解明が容易になります。しかし、骨髄前駆細胞はフィーダー層20,21, OP9 細胞をサポート システムで培養する必要があります、この異種細胞集団は主遺伝子撹乱のそれ以上の適用を制限ツール(例えば、siRNA による遺伝子サイレンシング) NK 細胞に特に適用されます。
ここでは、さらにウィリアムズら20の生体外でシステムを変更することによって開発されている無料の送り装置システムについて述べる。我々 のシステムで OP9 管間質フィーダー細胞に必須ではありません、OP9 条件付きのメディアが最近 NK 細胞培養、およびこれの分化に影響を与えずに使用を導く TGF-β は経由で癌の進行を促進することを明らかにする代わりに腫瘍微小環境22E4bp4 依存性 NK 細胞の発達を抑制します。この新しいシステムは、正常に特定条件下で NK 細胞の分化の分子機構を解明するため背景無料メソッドを提供します (例えば、高い TGF-β 1、siRNA による遺伝子サイレンシングなど)。生体外で。
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Protocol
プロトコル細胞 (BM NK) の取得と骨髄由来 NK を区別するは、以前に公開された方法20,21,22に基づいています。マウスですべてのプロシージャによって、動物倫理実験委員会 (AEEC) 香港の中国大学を承認されています。
1. OP9 条件付き媒体の作製
- 20 %fbs、100 U/mL ペニシリン G および加湿雰囲気空気/CO2の 37 ° C で、100 μ g/mL ストレプトマイシンを含むアルファ MEM でマウス間質細胞株 OP9 を文化 (95%: 5%)。
- 検定、種子 2 x 106 OP9 細胞各 75 cm2培養用フラスコの中の 15 ml のセルをカウントします。48 h のカルチャです。
- 文化では、80% の合流点に達すると、10 ml の PBS のフラスコを洗ってフラスコあたり (FBS と抗生物質) なしプレーン アルファ MEM 培地 20 mL を加えます。
- 24 h で培養用フラスコから OP9 条件媒体を収集、0.25 μ m ポリエーテルサルホン (PES) フィルターと細胞の残骸をきれいおよび 4 ° c (使用 2 週間以内) を保持します。
2. マウス骨髄細胞の分離
- ボーラスの過剰摂取 (100 mg/kg、腹腔内投与) と 12 週齢の c57bl/6 j マウスを安楽死させます。呼吸の不足によって死を確認し、骨間の接合でメス切断大腿骨骨を収穫し、穏やかなスクラッチでブレードと残りの筋肉を削除します。
- チルドの滅菌アルファ-MEM を含む 50 mL 遠心管中骨を置き、バイオ セーフティ キャビネットで次の手順を実行します。
- アルファ MEM 媒体を廃棄し、30 の 70% エタノールで骨をすすいでください s。
- 残りのエタノールをクリーンアップするために二度氷冷滅菌 PBS で骨を洗います。
- 5 mL の氷冷 PBS を含むモルタルの骨を転送し、優しく杵で骨を fragmentize (それらを粉砕していない)。
- PBS に骨髄細胞を解放する杵を旋回で骨を軽く揺り動かしなさい。新しい 50 mL の遠心管に PBS 含んでいる骨髄細胞を収集します。
- 骨片の色で白色の点灯になるまで 4 回の 2.6 ステップを繰り返します。
- 4 ° C で 5 分間 465 x g でチューブを遠心分離し、上澄みを廃棄します。
- 18 ml の滅菌蒸留水のペレットを再懸濁します、放置 30 s 赤の血液細胞を削除します。
- 冷たい 10 の 2 mL を加えて反応を停止する X PBS をフィルター処理混合物分離の赤い血液細胞を削除する 70 μ m セル ストレーナー。
- 4 ° C で 5 分間 465 x g でチューブを遠心分離します。20 mL の氷冷 PBS でペレットを再懸濁します。
- 2 回目 2.11 のステップを繰り返すことによって細胞を洗浄します。
- 100 mm 滅菌シャーレ OP9 ステップ 1.2 から条件付き媒体の 10 mL と 20 を添加した細胞ペレットに転送 %fbs と 0.5 ng/mL の混合物マウス IL-7、30 ng/mL マウス SCF と 100 U/mL マウス flt3L。
- 2.13 のステップと同じ中式と 5 x 105実行可能なセル/mL (トリパン ブルー排除で検定による細胞数) の密度で新しい培養容器に 5% CO2 2 h. 転送の 37 ° C で皿未接続の細胞を孵化します。、と 5% CO2と 37 ° C で孵化させなさい。
- 4 日目、OP9 条件培地に培養条件の変更は、FBS とマウス IL-2 の 2,000 U/mL 20% で補完。
- 更新の培養培地ごとに 3 日間。成熟 NK 細胞は日 7 によって得られる、セクション 4 のように修飾できます。
3. siRNA を介したサイレンシング NK 細胞の分化の
- プレミックス製品のマニュアルによるとトランスフェクション エージェントと siRNA またはナンセンス制御 (NC)。
- 0 日目から任意の時点でのステップ 3.1 を実行します。
- 追加、50 nM の siRNA またはステップ 2.14 からセルに NC の混合物。
- 実験の終了点までの (例えば0、4、および 7 日) すべての中のリフレッシュ ステップ 3.1 を繰り返します。
4. フローサイトメトリーを用いた NK 細胞分化の解析
- 適切な時点で分化細胞の懸濁液を収集し、氷冷 PBS で洗浄します。
- 製品マニュアルに従ってセル固定バッファーでセルを固定します。
- 氷冷 PBS の固定セルを洗浄し、フロー フローサイトメトリー染色バッファー含む Cy3 標識抗マウス NKp46 の 100 μ L で 1 × 106細胞との 1: 100 希釈倍率で抗マウス CD244 抗体を PE 共役を再懸濁します。
- サンプル 2 時間室温で暗闇の中を汚します。
- 300 μ L の PBS、ステンド グラス サンプルを再懸濁します、FACS データを取得し、Cytobank プラットフォーム20 (http://cytobank.org/) で分析します。
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Representative Results
代表の結果を取得するには、次の記載されているプロトコル。フィーダー無料分化システム 11 日間全骨髄細胞の懸濁液類栽培日 0 (図 1A) の総細胞数と比較して 7 日目で増殖率の大幅な増加が観察されました。細胞質に原子力比率が高いと顆粒の豊富な細胞質形態と成熟 NK 細胞 (図 1B) 6 日目で発見されました。
TGF-β 1/Smad3 は NK 細胞の分化、細胞が E4bp4 mRNA (siE4bp4、図 2に示すように、E4bp4 mRNA レベルを効果的に抑制する) またはナンセンスに対する siRNA を導入させた骨髄におけるシグナル伝達の調節作用を解明するためにコントロールを 0 日目と 4 日目フィーダー細胞のシステムを無料します。Smad3 阻害剤 SIS3 有無システムで 6 日間培養細胞。フロー分析検出のノックダウン E4bp4 は主として NK 細胞の成熟のようにの減少によって CD244+ ve NKp46-ve未熟な NK 細胞 NC transfected 制御と比較して一方 TGF-β 1/Smad3 活性化の抑制を抑制大幅 siE4BP4 トランスフェクション グループ (図 3) と比較して NK 細胞の成熟の siRNA を介した抑制を救助します。
図 1.フィーダー フリー システムから細胞の骨髄由来 NK のイメージ。骨髄の曲線細胞受けて NK 細胞の分化のシステムまでセルを数えることによって得られる日 11 (A) 成長。(B) の矢印で示されているように日 6、成熟 NK 細胞細胞質に原子力比率が高いと顆粒の豊富な細胞質形態が表示されます。倍率 200 x、スケール バー 50 μ m 3 の独立実験のデータを表す平均 ± SEM * * *p < 0.01。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2.6 日後に受けている NK 細胞の分化細胞の骨髄に siRNA による遺伝子サイレンシングの効果。細胞は、ナンセンス制御 (NC) または 0 日目と 4 日目のマウス E4bp4 mRNA (siE4bp4) をターゲットとする siRNA を導入させた。リアルタイム PCR を示します E4bp4 の mRNA 発現レベルが NC 群と比較して 6 日目に大きく扱われる si E4bp4 NK 細胞に減少しました。データを表す 3 の独立した実験の平均 ± SEM * *p < 0.05。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3.TGF β 1/Smad3 依存的にマウスの骨髄由来 NK 細胞の分化を阻害する E4bp4 のサイレンシングします。フローサイトメトリー解析のノックダウンを示しています (A) 流れ E4bp4 主システムを使用して無料のフィーダー体外ナンセンス制御 (NC) 群と比較して 6 日目の未熟 (CD244+ ve NKp46-ve) NK 細胞の生産が減少、TGF-β 1/Smad3 1 μ m SIS3 Smad3 阻害剤の活性化を抑制することによってすることができます大幅に救出されました。(B) 流動解析結果の定量化 * * *p < 0.01 NC; と比較して###p < 0.01 siE4BP4 導入群との比較します。3 独立した実験の代表的なデータが表示されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
補足図 1。6 日目の細胞の総差別化の NK 細胞マーカー発現の流れ解析のための戦略をゲーティングします。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
本研究では骨髄由来マウス NK 細胞の培養を生産するための手法を説明しました。オリジナル システム21,22細胞フィーダーは正常に OP9 細胞分化システムの安定性を大幅に増加したの条件の中に置き換えられます。さらに、システムは高い量を作り出すことができる、成熟 NK の純度培養し、体内の細胞の試金は、NK 細胞による疾患のトランスレーショナルリサーチと同様、解明を容易にすることができます。
この方法は、TGF-β 1 ががん開発23NK 細胞の抑制におけるシグナル伝達の調節的役割を調査するため使用されています。フィーダー細胞からの影響があったと抑制する阻害剤と同様に、siRNA による遺伝子ノックダウンの効率は大幅に改善します。フィーダー細胞 OP9 ノックダウンまたは23体外ターゲット遺伝子の抑制を示すことによって E4BP4 による NK 細胞の発達の Smad3 の生物学的機能を明確に示すことができます。
もっと重要なは、体内の試金のための遺伝子組み換えマウス NK 細胞の大量生産のためこのシステムをさらに活用できます。たとえば、我々 はこのシステムで単一のマウスの骨髄細胞から少なくとも 1 x 108成熟 NK 細胞を作り出したし、担 NOD/SCID マウス モデルの違いを示すために特定の遺伝子のノックダウンと NK 細胞がわいてがんを殺す効果体内23。確かに、その他の変更はウイルス媒介性遺伝子の過剰発現、細胞染色などなど、このシステムの NK 細胞で行うことができます。
ただし、その成熟 NK 細胞の最大 70% からとれる (データは示されていない)、9 日にシステム OP9 管間質・ ウィリアムズらによって示されている培養システムの結果と同様であります。21この制限を克服するために混合の NK 細胞ことができますさらに浄化する目的の人口を隔離するためのマシンとして商業 NK 細胞分離キットを並べ替え流。
結論としては、マウス骨髄細胞から NK 細胞を区別するための新しい方法が開発されています。この新しいシステムは、高純度と人間の病気で免疫の研究のための成熟 NK 細胞の量を取得するためのオプションを提供できます。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
本研究は研究-香港中文大学 (2016.035) と香港の学者の研究助成評議会の香港 (GRF 468513、12 r CUHK3/CRF) と革新と技術香港ファンド (ITS InP/164/16、ITS/227/15 ITS-InP/242/16)、直接助成金によって支えられました。プログラム。
H. Y.L. 設計しすべての実験を監督し、原稿の準備に貢献しました。午後-高橋啓介実験データを分析、原稿の準備に貢献しました。P. C. T.J.Y. ・ FC、t. j. s. c.、h.、Q.-m. w.、G. Y.L. 動物試料を収集し、動物実験に参加したと。X.-相対湿度、j. s. k. エフティが原稿を準備するに貢献したと。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| OP9 cell line | ATCC | ATCC® CRL-2749™ | |
| MEM α, no nucleosides | Gibco | 22561021 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10500064 | |
| PBS, pH 7.4 | Gibco | 10010049 | |
| Recombinant Murine IL-7 | PEPROTECH | 217-17 | |
| Recombinant Murine SCF | PEPROTECH | 250-03 | |
| Recombinant Murine Flt3-Ligand | PEPROTECH | 250-31L | |
| Recombinant Murine IL-2 | PEPROTECH | 212-12 | |
| Lipofectamin RNAiMAX Transfection Reagent | Invitrogen | 1377815 | |
| IC Fixation Buffer | eBioscience | 00-8222-49 | |
| Flow Cytometry Staining Buffer | eBioscience | 00-4222-26 | |
| PE-conjugated anti-mouse CD244 | eBioscience | 12-2441-83 | |
| Cy3-conjugated anti-mouse NKp46 | Bioss | bs-2417R-cy3 | |
| Nonsense control (NC) | Ribobio | siN05815122147 | |
| siRNA against mouse E4BP4 mRNA | Ribobio | N/A | 5′-GAUGAGGGUGUA GUGGGCAAGUCUU-3′ |
References
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