اختﻻق الواجهات الزجاجية الجودة البصرية لدراسة الانصهار بلعم
Summary
ويصف هذا البروتوكول تلفيق الواجهات الزجاجية الجودة البصرية تمتز مع المركبات المحتوية على المواد الهيدروكربونية سلسلة طويلة التي يمكن استخدامها لرصد الانصهار بلعم من العينات الحية وتمكن مجهرية فائقة القرار العينات الثابتة .
Abstract
وقد تم تحدي تصور تشكيل الخلايا العملاقة مولتينوكليتيد (مجكس) من العينات الحية يرجع ذلك إلى حقيقة أن يعيش أكثر من تقنيات التصوير تتطلب نشر الضوء من خلال الزجاج، ولكن على الزجاج بلعم فيوجن حدث نادر. ويقدم هذا البروتوكول تلفيق العديد من الواجهات الزجاجية الجودة البصرية حيث يتحول امتزاز المركبات المحتوية على المواد الهيدروكربونية سلسلة طويلة الزجاج في سطح فوسوجينيك. أولاً، يتم وصف إعداد الأسطح الزجاجية النظيفة كابتداء من المواد لتعديل السطح. ثانيا، ينص طريقة امتزاز المركبات المحتوية على المواد الهيدروكربونية سلسلة طويلة لتحويل الزجاج غير فوسوجينيك إلى الركازة فوسوجينيك. وثالثاً، يصف هذا البروتوكول تلفيق ميكروباتيرنس السطحية التي تشجع على درجة عالية من الرقابة الزمانية المكانية على تشكيل MGC. وأخيراً، يرد اختﻻق الأطباق أسفل الزجاج. وترد أمثلة لاستخدام هذا النظام الخلايا في المختبر كنموذج لدراسة الانصهار بلعم وتشكيل MGC.
Introduction
ويرافق تشكيل مجكس عددا من الحالات المرضية في جسم الإنسان المتميز بالتهاب مزمن1. وقد أظهرت الدراسات القليلة من المستغرب على الرغم من الاتفاق الذي مونونوكليتيد الضامة الصمامات على شكل مجكس2، الانصهار في سياق مع المعيشة العينات3،4. هذا سبب الأسطح الزجاجية النظيفة المطلوبة لمعظم تقنيات التصوير لا تعزز الانصهار بلعم عندما فعل السيتوكينات الالتهابية5. في الواقع، إذا كان الزجاج نظيفة كركيزة للانصهار بلعم، ثم منخفضة للأهداف المتوسطة التكبير (أي، 10-20 X) وأكثر من 15 ح المستمر غالباً ما مطلوبة تصوير الاحتفال بحدث واحد انصهار.
في اليد، والأسطح البلاستيكية فوسوجينيك (مثلاً، بيرمان) أو البلاستيك الصف البكتريولوجية الأخرى تعزيز الانصهار2. بيد أن التصوير من خلال البلاستيك يثير إشكالية لأن الركيزة سميكة وينثر الضوء. وهذا يزيد من تعقيد التصوير منذ فترة طويلة عامل المسافة (LWD) أهداف مطلوبة. ومع ذلك، عادة ما يكون أهداف LWD الإضاءة الخافتة جمع القدرات مقارنة بنظيرتها ساترة لتصحيح. علاوة على ذلك، تقنيات استغلال التغييرات في القطبية للضوء الذي يمر من خلال العينة مثل التدخل التفاضلية على النقيض من المستحيل نظراً للبلاستيك بيريفرينجينت. العوائق المرتبطة باستخدام البلاستيك هي أكدت حقيقة أن من المستحيل التنبؤ بحيث يحدث تشكيل الانصهار/MGC بلعم على السطح. معا، هذه القيود تحد من تصور الانصهار بلعم إلى مرحلة التباين البصريات، تمديد المدد التصوير الكلي (> 15 ساعة متواصلة)، ودقة منخفضة.
وقد حددنا مؤخرا سطح زجاج فوسوجينيك العالية أثناء إجراء الفحص المجهري جزيء واحد سوبر القرار مع الضامة الثابتة/مجكس4. هذه الملاحظة كان مفاجئاً نظراً لتنظيف زجاج الأسطح تعزيز الانصهار بمعدل منخفض جداً ~ 5% بعد 24 ساعة حضور انترلوكين-4 (إيل-4) كما تحددها الانصهار مؤشر4. لقد وجدنا أن القدرة على تعزيز الانصهار كان بسبب التلوث أوليميدي. أدلى الامتزاز أوليميدي أو مركبات أخرى وبالمثل الوارد الهيدروكربونات سلسلة طويلة فوسوجينيك الزجاج. فوسوجينيك معظم مجمع (شمع البارافين) ميكروباتيرنيد، وهو إضفاء درجة عالية من السيطرة الزمانية المكانية على الانصهار بلعم وإلى زيادة إضعاف في عدد الأحداث الانصهار لاحظ داخل نفس المقدار من الوقت مقارنة مع بيرمان. وقدمت هذه السطوح البصرية الجودة أول لمحة في الخصائص المورفولوجية والحركية التي تحكم تشكيل مجكس في العينات الحية.
في هذا البروتوكول وصف نحن تصنيع مجموعة متنوعة من الواجهات الزجاجية التي يمكن استخدامها لرصد تشكيل مجكس من العينات الحية. وباﻹضافة إلى ذلك، نعرض أن هذه الأسطح قابلة لتقنيات حل فائقة بعيدة الميدانية. تلفيق السطحية يعتمد على هدف التجربة، وهو وصف كل سطح مع الأمثلة ذات الصلة في نص الدعوى.
Protocol
Representative Results
Discussion
الحاجة إلى تحديد ووضع بعد ذلك الأسطح الزجاجية الجودة البصرية التي تعزز الانصهار بلعم تنبع من حقيقة أن تصور بلعم الانصهار في الإطار العيش حتى لا نشرت مؤخرا دراسة مباشرة العينات3، 4. وهذا يرجع إلى أن فوسوجينيك الأسطح البلاستيكية التي تستخدم عادة تتطلب أهداف L…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نود أن نشكر أعضاء المختبر أوجاروفا والمحققين في المركز الأيض وبيولوجيا الأوعية الدموية لمناقشة مفيدة لهذا العمل. جيمس فاوست يود أن يعرب عن امتنانه للمدربين في دورة “مختبر البيولوجيا الجزيئية الأوروبي سوبر قرار الفحص المجهري” في عام 2015. نود أن نشكر ساتيا يذكر في جانيليا للمساعدة في إعداد نموذج للسم. أثناء استعراض وتصوير أجزاء من هذا العمل وأيد جيمس فاوست زمالة T32 (5T32DK007569-28). عنصر “الورقة الضوء شعرية” في هذا العمل أيده HHMI ومؤسسة غوردون مور وبيتي. وتمول تريبهيوفان المعاهد الوطنية للصحة منح HL63199.
Materials
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PCD-32G | |
| Finder grid | Electron microscopy sciences | G400F1-Au | any gold TEM grid will work |
| Cover glass (22×22 mm) | Thor Labs | CG15CH | use only high stringency cover glass |
| Paraffin wax | Sigma Aldrich | 17310 | |
| Petrolatum | Sigma Aldrich | 16415 | must be α-tocopherol-free if substituted |
| Oleamide | Sigma Aldrich | O2136 | prepare fresh |
| Isopropanol | Sigma Aldrich | 278475 | |
| Toluene | Sigma Aldrich | 244511 | |
| Acetone | VWR International | BDH1101 | |
| Ethanol | Electron microscopy sciences | 15050 | use low dissolved solids ethanol |
| Hydrochloric acid | Fischer Scientific | A144C-212 | use to acid wash cover glass |
| Slyguard 184 | VWR International | 102092-312 | mix in a 1:10 ratio and cure at 50 °C for 4 h |
| 35 mm petri dish | Santa Cruz Biotech | sc-351864 | |
| Dumont no. 5 forceps | Electron microscopy sciences | 72705 | ideal for removing TEM grid in section 3.5 |
| FBS | Atlanta Biological | S11550 | |
| DMEM:F12 | Corning | 10-092 | contains 15 mM HEPES |
| Pen/Strept | Corning | 30-002-Cl | |
| HBSS | Corning | 21-023 | |
| BSA solution | Sigma Aldrich | A9576 | use at 0.1% in HBSS to wash non-adherent macrophages |
| IL-4 | Genscript | Z02996 | aliquot at 10 μg/mL and store at -20 °C |
| C57BL/6J | Jackson Laboratory | 000664 | use for fixed samples or techniques that do not require contrast agents |
| eGFP-LifeAct mice | n/a | n/a | use for live fluorescence imaging |
| Kimwipe | Kimberly Clark | 34155 | use to polish hydrocarbon adsorbed surfaces |
References
- McNally, A. K., Anderson, J. M. Interleukin-4 induces foreign body giant cells from human monocytes/macrophages. Differential lymphokine regulation of macrophage fusion leads to morphological variants of multinucleated giant cells. Am J Pathol. 147 (5), 1487 (1995).
- Helming, L., Gordon, S. Molecular mediators of macrophage fusion. Trends Cell Biol. 19 (10), 514-522 (2009).
- Podolnikova, N. P., Kushchayeva, Y. S., Wu, Y., Faust, J., Ugarova, T. P. The Role of Integrins α M β 2 (Mac-1, CD11b/CD18) and α D β 2 (CD11d/CD18) in Macrophage Fusion. Am J Pathol. 186 (8), 2105-2116 (2016).
- Faust, J. J., Christenson, W., Doudrick, K., Ros, R., Ugarova, T. P. Development of fusogenic glass surfaces that impart spatiotemporal control over macrophage fusion: Direct visualization of multinucleated giant cell formation. Biomaterials. 128, 160-171 (2017).
- Jenney, C. R., Anderson, J. M. Alkylsilane-modified surfaces: Inhibition of human macrophage adhesion and foreign body giant cell formation. J Biomed Mater Res. 46 (1), 11-21 (1999).
- Vignery, A. Methods to fuse macrophages in vitro. Cell Fusion: Overviews Methods. , 383-395 (2008).
- Zhao, Q., et al. Foreign-body giant cells and polyurethane biostability: In vivo correlation of cell adhesion and surface cracking. J Biomed Mater Res. 25 (2), 177-183 (1991).
- Anderson, J. M., Rodriguez, A., Chang, D. T. Foreign body reaction to biomaterials. Semin Immunol. 20 (2), 86-100 (2008).
- Jenney, C. R., Anderson, J. M. Effects of surface-coupled polyethylene oxide on human macrophage adhesion and foreign body giant cell formation in vitro. J Biomed Mater Res. 44 (2), 206-216 (1999).
- DeFife, K. M., Colton, E., Nakayama, Y., Matsuda, T., Anderson, J. M. Spatial regulation and surface chemistry control of monocyte/macrophage adhesion and foreign body giant cell formation by photochemically micropatterned surfaces. J Biomed Mater Res. 45 (2), 148-154 (1999).
- Jenney, C. R., DeFife, K. M., Colton, E., Anderson, J. M. Human monocyte/macrophage adhesion, macrophage motility, and IL-4-induced foreign body giant cell formation on silane-modified surfaces in vitro. J Biomed Mater Res. 41 (2), 171-184 (1998).
- Hell, S. W., Wichmann, J. Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy. Opt Lett. 19 (11), 780-782 (1994).
- van de Linde, S., et al. Direct stochastic optical reconstruction microscopy with standard fluorescent probes. Nat Protocols. 6 (7), 991-1009 (2011).
- Fölling, J., et al. Fluorescence nanoscopy by ground-state depletion and single-molecule return. Nat Methods. 5 (11), 943-945 (2008).
- Heilemann, M., et al. Subdiffraction-resolution fluorescence imaging with conventional fluorescent probes. Ange Chem Int Edit. 47 (33), 6172-6176 (2008).
- Betzig, E. Proposed method for molecular optical imaging. Optics Letters. 20 (3), 237-239 (1995).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Shtengel, G., et al. Interferometric fluorescent super-resolution microscopy resolves 3D cellular ultrastructure. P Natl Acad Sci U S A. 106 (9), 3125-3130 (2009).
- Shtengel, G., et al. Imaging cellular ultrastructure by PALM, iPALM, and correlative iPALM-EM. Method Cell Biol. 123, 273-294 (2013).
- Chen, B. C., et al. Lattice light-sheet microscopy: Imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution. Science. 346 (6208), 1257998 (2014).
- Planchon, T. A., et al. Rapid three-dimensional isotropic imaging of living cells using Bessel beam plane illumination. Nat Methods. 8 (5), 417-423 (2011).
