Realizzazione di superfici di vetro di qualità ottica per studiare macrofago Fusion
Summary
Questo protocollo descrive la realizzazione di superfici di vetro di qualità ottica adsorbito con composti contenenti idrocarburi a catena lunga che possono essere utilizzati per monitorare la fusione del macrofago di esemplari vivi e consente la microscopia di Super-risoluzione di campioni fissati .
Abstract
Visualizzare la formazione di cellule giganti multinucleated (MGCs) da esemplari viventi è stato impegnativo per il fatto che richiedono tecniche di imaging più diretta propagazione della luce attraverso il vetro, ma il vetro fusione del macrofago è un evento raro. Questo protocollo presenta la realizzazione di diverse superfici di vetro di qualità ottica dove adsorbimento di composti contenenti idrocarburi a catena lunga trasforma il vetro in una superficie di fusogena. In primo luogo, la preparazione delle superfici di vetro pulito come materiale di partenza per modifica di superficie è descritto. In secondo luogo, viene fornito un metodo per l’adsorbimento di composti contenenti idrocarburi a catena lunga per convertire non fusogena vetro in un substrato fusogena. In terzo luogo, questo protocollo descrive la fabbricazione di superficie microfantasie che promuovono un alto grado di controllo spatiotemporal sopra formazione MGC. Infine, fabbricando piatti di vetro inferiore è descritto. Vengono illustrati esempi di utilizzo di questo sistema di cellule in vitro come un modello per studiare la fusione del macrofago e formazione MGC.
Introduction
La formazione di MGCs accompagna un numero di stati patologici del corpo umano caratterizzata da infiammazione cronica1. Nonostante l’accordo che mononucleate macrofagi si fondono per formare MGCs2, sorprendentemente pochi studi hanno dimostrato la fusione nel contesto con soggiorno esemplari3,4. Questo è perché le superfici di vetro pulito che sono necessari per la maggior parte delle tecniche di imaging non promuovono la fusione del macrofago quando indotta da citochine infiammatorie5. Infatti, se vetro pulito è usato come substrato per la fusione dei macrofagi quindi bassa e obiettivi intermedi ingrandimento (cioè, 10-20x) e più di 15 h di continuo imaging spesso sono tenuti a osservare un evento unico di fusione.
Sulla mano, fusogena superfici plastiche (ad esempio, permanox) o plastica di qualità batteriologica promuovere fusion2. Tuttavia, imaging attraverso plastica è problematica perché il substrato è spesso e disperde la luce. Questo complica di imaging poiché obiettivi di lungo lavoro distanza (LWD) sono richiesti. Tuttavia, gli obiettivi LWD hanno solitamente bassa capacità rispetto alla loro controparte vetrino coprioggetti-corretta di raccolta della luce. Inoltre, tecniche che sfruttano le modifiche nella polarità della luce che passa attraverso il campione come contrasto differenziale di interferenza sono impossibili, dato che la plastica è birifrangente. Le barriere associate all’uso di plastica sono ulteriormente sottolineate dal fatto che è impossibile prevedere dove si verificheranno formazione fusion/MGC del macrofago sulla superficie. Insieme, queste limitazioni limitano la visualizzazione di fusione dei macrofagi all’ottica di contrasto di fase, estesa totale imaging durate (> 15 ore continue) e bassa risoluzione.
Recentemente abbiamo identificato una superficie di vetro altamente fusogena durante lo svolgimento di microscopia di singola molecola super risoluzione con macrofagi fisso/MGCs4. Questa osservazione è stato sorprendente, perché pulire vetro superfici promuovono fusione al tasso molto basso di ~ 5% dopo 24 h in presenza di interleuchina-4 (IL-4) come determinato dalla fusione di indice4. Abbiamo trovato che la capacità di promuovere la fusione era dovuto contaminazione oleamide. Adsorbimento di oleamide o altri composti che similmente contenuto idrocarburi a catena lunga fatta il fusogena di vetro. La maggior parte fusogena composto (paraffina) era bioerodibili e impartito un alto grado di controllo spatiotemporal fusione del macrofago e un aumento di 2 volte del numero di eventi di fusione osservato entro la stessa quantità di tempo rispetto alla permanox. Queste superfici di qualità ottica fornito il primo assaggio nelle caratteristiche morfologiche e cinetica che presiedono alla formazione di MGCs in esemplari viventi.
In questo protocollo Descriviamo la fabbricazione di una varietà di superfici di vetro che può essere utilizzato per monitorare la formazione di MGCs da esemplari viventi. Inoltre, ci mostra che queste superfici sono favorevoli alle tecniche di Super-risoluzione campo lontano. Montaggio superficiale dipenda l’obiettivo dell’esperimento, e ogni superficie è descritta con gli esempi correlati nel testo procedere.
Protocol
Representative Results
Discussion
La necessità di identificare e successivamente sviluppare superfici di vetro di qualità ottica che promuovono la fusione del macrofago derivava dal fatto che fino a Studio non pubblicato di recente direttamente visualizzate fusione del macrofago nel contesto di vita esemplari3, 4. Questo è dovuto al fatto che fusogena superfici di plastica che sono comunemente usate richiedono obiettivi LWD e sono in gran parte limitate a ottica di contrasto di fase. Questi o…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Desideriamo ringraziare i membri del laboratorio di Ugarova e gli investigatori nel centro per biologia vascolare e metabolica per utile discussione su quest’opera. James Faust desidera esprimere la sua gratitudine agli istruttori presso il corso di biologia molecolare europeo laboratorio Super risoluzione microscopia nel 2015. Desideriamo ringraziare Satya Khuon al Janelia per informazioni sulla preparazione del campione per LLSM. Durante la revisione e filmare parti di questo lavoro James Faust è stato supportato da una borsa di studio T32 (5T32DK007569-28). Il componente foglio di Lattice luce di quest’opera è stato sostenuto dal HHMI e Betty e Gordon Moore Foundation. T.U. è finanziato dal NIH concedere HL63199.
Materials
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PCD-32G | |
| Finder grid | Electron microscopy sciences | G400F1-Au | any gold TEM grid will work |
| Cover glass (22×22 mm) | Thor Labs | CG15CH | use only high stringency cover glass |
| Paraffin wax | Sigma Aldrich | 17310 | |
| Petrolatum | Sigma Aldrich | 16415 | must be α-tocopherol-free if substituted |
| Oleamide | Sigma Aldrich | O2136 | prepare fresh |
| Isopropanol | Sigma Aldrich | 278475 | |
| Toluene | Sigma Aldrich | 244511 | |
| Acetone | VWR International | BDH1101 | |
| Ethanol | Electron microscopy sciences | 15050 | use low dissolved solids ethanol |
| Hydrochloric acid | Fischer Scientific | A144C-212 | use to acid wash cover glass |
| Slyguard 184 | VWR International | 102092-312 | mix in a 1:10 ratio and cure at 50 °C for 4 h |
| 35 mm petri dish | Santa Cruz Biotech | sc-351864 | |
| Dumont no. 5 forceps | Electron microscopy sciences | 72705 | ideal for removing TEM grid in section 3.5 |
| FBS | Atlanta Biological | S11550 | |
| DMEM:F12 | Corning | 10-092 | contains 15 mM HEPES |
| Pen/Strept | Corning | 30-002-Cl | |
| HBSS | Corning | 21-023 | |
| BSA solution | Sigma Aldrich | A9576 | use at 0.1% in HBSS to wash non-adherent macrophages |
| IL-4 | Genscript | Z02996 | aliquot at 10 μg/mL and store at -20 °C |
| C57BL/6J | Jackson Laboratory | 000664 | use for fixed samples or techniques that do not require contrast agents |
| eGFP-LifeAct mice | n/a | n/a | use for live fluorescence imaging |
| Kimwipe | Kimberly Clark | 34155 | use to polish hydrocarbon adsorbed surfaces |
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