대 식 세포 융합 연구 품질 광학 유리 표면 조작
Summary
이 프로토콜에 설명 합니다 품질 광학 유리 표면 흡착 고정 표본 슈퍼 해상도 현미경을 가능 하 게 살아있는 표본의 대 식 세포 융합을 모니터링 하는 데 사용할 수 있는 긴 사슬 탄화수소를 포함 하는 화합물으로 제조를 .
Abstract
Multinucleated 거 대 한 세포 (MGCs)의 형성을 시각화 하는 살아있는 표본에서 가장 라이브 이미징 기술이 필요로 유리를 통해, 빛의 전파 이지만 유리에 대 식 세포 융합 드문 이벤트는 사실 때문 도전 하고있다. 이 프로토콜 제공 여러 품질 광학 유리 표면의 제조 긴 사슬 탄화수소를 포함 하는 화합물의 흡착 fusogenic 표면으로 유리를 변환 합니다. 첫째, 표면 개 질에 대 한 자료를 시작으로 깨끗 한 유리 표면 준비 설명 되어 있습니다. 둘째, fusogenic 기판에 변환 비 fusogenic 유리 하 긴 사슬 탄화수소를 포함 하는 화합물의 흡착에 대 한 메서드가 제공 됩니다. 셋째,이 프로토콜 spatiotemporal 제어할 MGC 형성의 높은 학위를 홍보 하는 표면 micropatterns의 제작을 설명 합니다. 마지막으로, 유리 하단 요리 조작 설명 되어 있습니다. 시스템의 사용이 체 외에서 세포 대 식 세포 융합, MGC 형성 연구 모델의 예로 표시 됩니다.
Introduction
MGCs의 대형 다양을 한 만성 염증1고유 인체에 병 적인 상태를 동반 한다. 계약 형태 MGCs2mononucleated 세포 융합에 불구 하 고 의외로 몇 연구 퓨전 생활 맥락에서 표본3,4. 이 때문에 대부분의 이미징 기법에 필요한 깨끗 한 유리 표면 염증 성 cytokines5에 의해 유도 된 때 대 식 세포 융합을 촉진 하지 않습니다. 실제로, 깨끗 한 유리 사용 하는 경우는 기질으로 대 식 세포 융합, 다음에 대 한 중간 확대 목표 (즉, 10-20 X) 하의 연속 이상 15 h 낮은 이미징 종종 필요 단일 퓨전 이벤트를 관찰 합니다.
다른 손, fusogenic 플라스틱 표면 (예를 들어, permanox) 또는 세균 학년 플라스틱에 퓨전2홍보. 그러나, 플라스틱을 통해 영상 이므로 문제가 기판 두께 이며 빛을 없앤다. 이 긴 작업 거리 (LWD) 목표는 필요한 이후 이미징 복잡. 그러나, LWD 목표는 일반적으로 낮은 조명 coverslip 수정 그들의 대응에 비해 용량 수집 있다. 또한, 미분 간섭 명암 등 견본을 통과 하는 빛의 극성에 변화를 악용 하는 기법 없습니다 가능한 플라스틱 birefringent 이므로. 플라스틱의 사용과 관련 된 장벽은 대 식 세포 융합/MGC 형성 표면에 발생 합니다 예측할 수는 없습니다는 사실에 의해 더 강조 된다. 함께, 이러한 제한 제한 단계 대조 광학, 총 이미징 기간 연장에 대 식 세포 융합의 시각화 (> 15 연속 시간), 그리고 낮은 해상도.
우리는 최근 고정 세포/MGCs4단일 분자 슈퍼 해상도 현미경을 수행 하는 동안 매우 fusogenic 유리 표면을 식별. 이 관찰 했다 유리 청소 때문에 외 표면 촉진의 매우 낮은 속도로 퓨전 ~ 5% 후 인터 루 킨-4 (IL-4) 융해에 의해 결정 된 대로 존재 24 h 색인4. 우리는 발견 퓨전 홍보 용량 oleamide 오염 때문. Oleamide 또는 유사 하 게 긴 사슬 탄화수소를 포함 하는 다른 화합물의 흡착 유리 fusogenic를 했다. 대부분 fusogenic 화합물 (파라핀 왁 스) micropatterned, 고 대 식 세포 융합 및 융합 이벤트는 같은 시간 내에 permanox에 비해 관찰 수에 2-fold 증가 spatiotemporal 제어의 높은 학위를이 수 있습니다. 이러한 광학 품질 서피스 형태 기능 및 생활 표본에서 MGCs의 형성을 제어 하는 활동으로 첫 번째 엿볼 제공.
이 프로토콜에 우리 살아있는 표본에서 MGCs의 형성을 모니터링 하는 데 사용할 수 있는 유리 표면의 다양 한의 제작을 설명 합니다. 또한, 우리는 이러한 서피스는 의무가 멀리 필드 슈퍼 해상도 기법을 보여줍니다. 표면 제작, 실험의 목표에 따라 달라 집니다 그리고 각 표면 진행 텍스트에 관련 된 예제와 함께 설명.
Protocol
Representative Results
Discussion
확인 하 고 이후에 대 식 세포 융합을 촉진 하는 품질 광학 유리 표면 개발 필요 사실 더 최근에 출판 된 연구 직접까지 생활의 맥락에서 대 식 세포 융합을 시각에서 비롯 된 표본3, 4. 일반적으로 사용 되는 fusogenic 플라스틱 표면 LWD 목표 요구 되며 단계 대조 광학으로 제한는 사실 때문입니다. 이 방 벽 뿐만 아니라 대 식 세포 융합의 특별 한 요금을 추…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리가 감사 멤버 Ugarova 실험실 및 센터에 수 사관의 대사와 혈관 생물학에 대 한이 작품의 유용한 토론 하고자 합니다. 제임스 파우스트 2015 년에서 유럽 분자 생물학 실험실 슈퍼 해상도 현미경 코스에서 강사에 게 그의 감사를 표현 하고자 합니다. LLSM에 대 한 샘플 준비에 대 한 Janelia에서 Satya 쿠 온 감사 하 길. 검토 하 고이 작품의 촬영 부분 동안 제임스 파우스트 T32 화목 (5T32DK007569-28)에 의해 지원 되었다. 이 작품의 격자 빛 시트 구성 요소는 HHMI 및 베티와 고 든 무어 재단에 의해 지원 되었다. T.U.는 NIH에 의해 투자 된 HL63199를 부여.
Materials
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PCD-32G | |
| Finder grid | Electron microscopy sciences | G400F1-Au | any gold TEM grid will work |
| Cover glass (22×22 mm) | Thor Labs | CG15CH | use only high stringency cover glass |
| Paraffin wax | Sigma Aldrich | 17310 | |
| Petrolatum | Sigma Aldrich | 16415 | must be α-tocopherol-free if substituted |
| Oleamide | Sigma Aldrich | O2136 | prepare fresh |
| Isopropanol | Sigma Aldrich | 278475 | |
| Toluene | Sigma Aldrich | 244511 | |
| Acetone | VWR International | BDH1101 | |
| Ethanol | Electron microscopy sciences | 15050 | use low dissolved solids ethanol |
| Hydrochloric acid | Fischer Scientific | A144C-212 | use to acid wash cover glass |
| Slyguard 184 | VWR International | 102092-312 | mix in a 1:10 ratio and cure at 50 °C for 4 h |
| 35 mm petri dish | Santa Cruz Biotech | sc-351864 | |
| Dumont no. 5 forceps | Electron microscopy sciences | 72705 | ideal for removing TEM grid in section 3.5 |
| FBS | Atlanta Biological | S11550 | |
| DMEM:F12 | Corning | 10-092 | contains 15 mM HEPES |
| Pen/Strept | Corning | 30-002-Cl | |
| HBSS | Corning | 21-023 | |
| BSA solution | Sigma Aldrich | A9576 | use at 0.1% in HBSS to wash non-adherent macrophages |
| IL-4 | Genscript | Z02996 | aliquot at 10 μg/mL and store at -20 °C |
| C57BL/6J | Jackson Laboratory | 000664 | use for fixed samples or techniques that do not require contrast agents |
| eGFP-LifeAct mice | n/a | n/a | use for live fluorescence imaging |
| Kimwipe | Kimberly Clark | 34155 | use to polish hydrocarbon adsorbed surfaces |
References
- McNally, A. K., Anderson, J. M. Interleukin-4 induces foreign body giant cells from human monocytes/macrophages. Differential lymphokine regulation of macrophage fusion leads to morphological variants of multinucleated giant cells. Am J Pathol. 147 (5), 1487 (1995).
- Helming, L., Gordon, S. Molecular mediators of macrophage fusion. Trends Cell Biol. 19 (10), 514-522 (2009).
- Podolnikova, N. P., Kushchayeva, Y. S., Wu, Y., Faust, J., Ugarova, T. P. The Role of Integrins α M β 2 (Mac-1, CD11b/CD18) and α D β 2 (CD11d/CD18) in Macrophage Fusion. Am J Pathol. 186 (8), 2105-2116 (2016).
- Faust, J. J., Christenson, W., Doudrick, K., Ros, R., Ugarova, T. P. Development of fusogenic glass surfaces that impart spatiotemporal control over macrophage fusion: Direct visualization of multinucleated giant cell formation. Biomaterials. 128, 160-171 (2017).
- Jenney, C. R., Anderson, J. M. Alkylsilane-modified surfaces: Inhibition of human macrophage adhesion and foreign body giant cell formation. J Biomed Mater Res. 46 (1), 11-21 (1999).
- Vignery, A. Methods to fuse macrophages in vitro. Cell Fusion: Overviews Methods. , 383-395 (2008).
- Zhao, Q., et al. Foreign-body giant cells and polyurethane biostability: In vivo correlation of cell adhesion and surface cracking. J Biomed Mater Res. 25 (2), 177-183 (1991).
- Anderson, J. M., Rodriguez, A., Chang, D. T. Foreign body reaction to biomaterials. Semin Immunol. 20 (2), 86-100 (2008).
- Jenney, C. R., Anderson, J. M. Effects of surface-coupled polyethylene oxide on human macrophage adhesion and foreign body giant cell formation in vitro. J Biomed Mater Res. 44 (2), 206-216 (1999).
- DeFife, K. M., Colton, E., Nakayama, Y., Matsuda, T., Anderson, J. M. Spatial regulation and surface chemistry control of monocyte/macrophage adhesion and foreign body giant cell formation by photochemically micropatterned surfaces. J Biomed Mater Res. 45 (2), 148-154 (1999).
- Jenney, C. R., DeFife, K. M., Colton, E., Anderson, J. M. Human monocyte/macrophage adhesion, macrophage motility, and IL-4-induced foreign body giant cell formation on silane-modified surfaces in vitro. J Biomed Mater Res. 41 (2), 171-184 (1998).
- Hell, S. W., Wichmann, J. Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy. Opt Lett. 19 (11), 780-782 (1994).
- van de Linde, S., et al. Direct stochastic optical reconstruction microscopy with standard fluorescent probes. Nat Protocols. 6 (7), 991-1009 (2011).
- Fölling, J., et al. Fluorescence nanoscopy by ground-state depletion and single-molecule return. Nat Methods. 5 (11), 943-945 (2008).
- Heilemann, M., et al. Subdiffraction-resolution fluorescence imaging with conventional fluorescent probes. Ange Chem Int Edit. 47 (33), 6172-6176 (2008).
- Betzig, E. Proposed method for molecular optical imaging. Optics Letters. 20 (3), 237-239 (1995).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Shtengel, G., et al. Interferometric fluorescent super-resolution microscopy resolves 3D cellular ultrastructure. P Natl Acad Sci U S A. 106 (9), 3125-3130 (2009).
- Shtengel, G., et al. Imaging cellular ultrastructure by PALM, iPALM, and correlative iPALM-EM. Method Cell Biol. 123, 273-294 (2013).
- Chen, B. C., et al. Lattice light-sheet microscopy: Imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution. Science. 346 (6208), 1257998 (2014).
- Planchon, T. A., et al. Rapid three-dimensional isotropic imaging of living cells using Bessel beam plane illumination. Nat Methods. 8 (5), 417-423 (2011).
