Trans-innere Zelle Masse Injektion von embryonalen Stammzellen führt zu höheren Chimerism Raten
Summary
Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Erhöhung der Chimäre Produktion ohne den Einsatz von neuen Geräten. Eine einfache Orientierung Änderung des Embryos zur Injektion kann erhöhen Sie die Anzahl der erzeugten Embryonen und potenziell reduzieren die Timeline Germline Übertragung.
Abstract
In dem Bemühen zur Steigerung der Effizienz bei der Erstellung von genetisch veränderten Mäusen über ES Zelle Methoden präsentieren wir Ihnen eine Anpassung an das aktuelle Protokoll der Blastozyste-Injektion. Hier berichten wir, dass eine einfache Drehung des Embryo und Injektion durch Trans-innere Zellmasse (TICM) der Anteil der chimeric Mäuse von 31 % bis 50 %, ohne zusätzliche Ausrüstung stieg oder Ausbildung weiter spezialisiert. 26 verschiedene Inzucht Klone und 35 insgesamt Klone wurden über einen Zeitraum von 9 Monaten injiziert. Es gab keinen signifikanten Unterschied in Schwangerschaftsrate oder Verwertungsquote von Embryonen zwischen traditionellen Injektionstechniken und TICM. Daher kann ohne jede große Veränderung in der Einspritzvorgang und eine einfache Positionierung der Blastozyste und Injektion durch das ICM, Freisetzung von ES-Zellen in den blastocöl Hohlraum möglicherweise die Menge der Chimären Produktion und anschließende verbessern Germline Übertragung.
Introduction
Die Schaffung von genetisch gezielte Mäusen ist seit fast 25 Jahren ein langsamer Prozess, oft durch einen Engpass im Blastozysten ES Zell Mikroinjektion-Stadium für die Generation der Keimbahn Übertragung von Chimären behindert. Neue Zuführungen, darunter CRISPR/Cas91,2 targeting in ES-Zellen und Hochdurchsatz-ES Handy-Generation Konsortien wie KOMP, haben die Generation/Verfügbarkeit von gentechnisch veränderten ES-Zellen verbessert. Die Generation der Keimbahn Chimären bleibt jedoch einen Engpass bei der Schaffung von genetisch veränderter Mäusen aus diesen ES Zellen3,4. Hochdurchsatz-ES Zelle stromerzeugungsprojekte haben durch hohe Variabilität in ES-Zellen-Qualität, die entscheidend für die erfolgreiche Erstellung der Keimbahn Chimären ist geplagt. Darüber hinaus sind einige der häufig verwendeten ES-Zelllinien für hohe Aneuploidie und schwierige Produktion der Keimbahn zuständigen Chimären5bekannt.
Viele Methoden wurden entwickelt für die Erstellung von Mäusen mit entweder eine höhere Chimäre oder komplett ES Zelle abgeleitet Mäuse6,7,8,9,10. Während jedes dieser Systeme seine eigenen Vorzüge hat, haben sie auch ihre Schwächen. Die Generation der tetraploiden Chimären, während generieren 100 % ES Zelle Mäuse, abgeleitet ist ineffizient und in der Regel beschränkt auf fremd-Linien 5,6. Neuere Methoden der Morula Injektion können Ausbeute hohen Prozentsatz Chimären, annähernd 100 %, aber erfordern in der Regel erhebliche zusätzliche Ausrüstung (Laser oder Piezos) und Training10,11. Im Labor, wo diese Techniken bereits vorhanden sind, kann diese neue Methode nicht erforderlich sein.
Ziel dieser Studie war es, eine Methode zu finden, die gängige Techniken und leicht verfügbare Ausrüstung zur Erhöhung der Chimäre-Generation, die Chance der Keimbahn Übertragung des mutierten Allels, die anschließende Maus Kolonie zu erhöhen verwendet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Es hat lange gedacht, dass jede Störung des ICM aktuellen Blastozyste Mikroinjektion Protokolle warnen noch dieser12,13zur Sterblichkeit, in der Tat führen könnte. Was wir hier gezeigt haben ist, die Mikroinjektion durch das ICM ist nicht schädlich für den Embryo und erhöht den Ertrag der Chimären.
Der genaue Mechanismus für diesen Effekt wurde nicht festgestellt. Allerdings sollte die mechanische Beeinträchtigung der ICM und …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Forschung wurde von der intramuralen Forschungsprogramm des NIH, National Institute of Environmental Health Sciences [teilweise] unterstützt. Besonderen Dank an Shyamal Peddada für statistische Analysen. Wir wünschen auch Humphrey Yao, Gary Vogel und Yuki Arao zur Überprüfung dieser Handschrift, und Franco DeMayo für seine anhaltende Unterstützung und Beratung bedanken.
Materials
| ES Cell injection needle | Humagen | MSC-20-0 | |
| NSET device | Paratechs | 60010 | |
| DMEM | Gibco (life technologies) | 11965-092 | |
| FBS | Gibco (life technologies) | 10439-024 | lots should be individually tested for ES Cell compatibility. |
| HEPES | Sigma | H0887 | |
| b-mercaptoethanol | Sigma | M7522 | |
| Micro manipulator | Leica | Micro manipulator | |
| micro injector | Eppendorf AG | Cell Tram Air 5176 | |
| Microscope | Leica | DM IRB | |
| 4 well dish | Thermo Scientific | 176740 | |
| 60 mm dish | Sarstedt | 83.3901 | |
| B6(Cg)-Tyr<c-2J>/J | Jackson Labs, Bar Harbor, Maine, USA | 000058 | |
| Swiss Webster mice | Taconic, USA | Tac:SW | |
| Injection Dish | MatTek Corp. | P50G-0-30-F |
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