Trans-inner Cell Mass iniezione delle cellule staminali embrionali porta a tassi più elevati di chimerismo
Summary
Qui presentiamo un protocollo per aumentare la produzione di chimera senza l’uso di nuove attrezzature. Un cambiamento di orientamento semplice dell’embrione per iniezione può aumentare il numero di embrioni prodotti e potenzialmente ridurre la timeline di trasmissione nella linea germinale.
Abstract
Nel tentativo di aumentare l’efficienza nella creazione di topi geneticamente modificati tramite metodologie delle cellule di ES, presentiamo un adattamento per l’attuale protocollo di iniezione di blastocisti. Qui segnaliamo che una semplice rotazione dell’embrione e iniezione attraverso massa cellulare Trans-interno (TICM) ha aumentato la percentuale dei topi chimerici dal 31% al 50%, con nessun equipaggiamento supplementare o ulteriore formazione specialistica. inbred 26 differenti cloni, e cloni totali 35 sono stati iniettati in un periodo di 9 mesi. Non c’era differenza significativa nel tasso di recupero di embrioni o di tasso di gravidanza tra tecniche di iniezione tradizionale e TICM. Pertanto, senza alcuna alterazione principali nel processo di iniezione e un semplice posizionamento della blastocisti e iniettare attraverso l’ICM, rilasciando le cellule ES nella cavità Blastocele possa potenzialmente migliorare la quantità di produzione chimerici e successive trasmissione nella linea germinale.
Introduction
Per quasi 25 anni, la creazione di topi geneticamente mirati è stato un processo lento, spesso ostacolato da un collo di bottiglia nella fase blastocisti ES cella microiniezione per la generazione di germline trasmissione chimere. Gli avanzamenti recenti, tra cui CRISPR/Cas91,2 di targeting in cellule ES ed ES di alto-rendimento cella consorzi di generazione come KOMP, hanno migliorato la disponibilità/generazione di cellule geneticamente modificate ES. Tuttavia, la generazione di germline chimere rimane un collo di bottiglia nella creazione di topi geneticamente modificati da queste cellule ES3,4. Progetti di generazione di alto-rendimento ES cella sono stati afflitti da alta variabilità nella qualità delle cellule di ES, che è fondamentale per la riuscita creazione di chimere di germline. Inoltre, alcune delle varietà di cellula ES comunemente utilizzati sono noti per aneuploidia alta e difficile produzione di germline chimere competente5.
Sono stati sviluppati molti metodi per la creazione di topi con una chimera o superiore, o completamente delle cellule di ES derivato topi6,7,8,9,10. Mentre ciascuno di questi sistemi ha i suoi meriti, hanno anche le loro carenze. La generazione delle chimere tetraploide, mentre la generazione delle cellule di ES 100% derivato topi, è inefficiente e generalmente limitata a linee nazionali 5,6. Recensioni più recenti metodi di iniezione morula possono produrre alta percentuale chimere, prossima al 100%, ma in genere richiedono significative ulteriori apparecchiature (laser o piezo) e formazione10,11. Nei laboratori dove queste tecniche sono già in atto, questa nuova metodologia potrebbe non essere necessaria.
Obiettivo di questo studio era di trovare un metodo che utilizza tecniche comuni e prontamente disponibili attrezzature per aumentare il tasso di generazione di chimera, aumentando la probabilità di trasmissione nella linea germinale dell’allele del mutante per fondare la Colonia del mouse successiva.
Protocol
Representative Results
Discussion
Si è a lungo pensato che qualsiasi disturbo del ICM potrebbe portare alla mortalità, infatti, protocolli di microinjection di blastocisti correnti ancora avvertono di questo12,13. Quello che vi abbiamo mostrato qui è che microiniezione attraverso l’ICM non è dannosa per l’embrione e aumenta la resa delle chimere.
L’esatto meccanismo di questo effetto non è stato identificato. Tuttavia, la rottura meccanica del ICM e l’accompagname…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questa ricerca è stata sostenuta [in parte] dal programma di ricerca intramurale del NIH, National Institute of Environmental Health Sciences. Si ringrazia Shyamal Peddada per l’analisi statistica. Desideriamo anche ringraziare Humphrey Yao, Gary Bird e Yuki Arao per la revisione di questo manoscritto e Franco DeMayo per il suo continuo supporto e consulenza.
Materials
| ES Cell injection needle | Humagen | MSC-20-0 | |
| NSET device | Paratechs | 60010 | |
| DMEM | Gibco (life technologies) | 11965-092 | |
| FBS | Gibco (life technologies) | 10439-024 | lots should be individually tested for ES Cell compatibility. |
| HEPES | Sigma | H0887 | |
| b-mercaptoethanol | Sigma | M7522 | |
| Micro manipulator | Leica | Micro manipulator | |
| micro injector | Eppendorf AG | Cell Tram Air 5176 | |
| Microscope | Leica | DM IRB | |
| 4 well dish | Thermo Scientific | 176740 | |
| 60 mm dish | Sarstedt | 83.3901 | |
| B6(Cg)-Tyr<c-2J>/J | Jackson Labs, Bar Harbor, Maine, USA | 000058 | |
| Swiss Webster mice | Taconic, USA | Tac:SW | |
| Injection Dish | MatTek Corp. | P50G-0-30-F |
References
- Cong, L., et al. Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems. Science. 339 (6), 819-823 (2013).
- Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6), 823-826 (2013).
- Friedel, R., Seisenberger, C., Kaloff, C., Wurst, W. EUCOMM the European Conditional Mouse Mutagenesis Program. Brief Funct Genomic Proteomic. 6 (3), 180-185 (2007).
- Austin, C. P., et al. The knockout mouse project. Nat Genet. 36 (9), 921-924 (2004).
- Coleman, J. L., Brennan, K., Ngo, T., Balaji, P., Graham, R. M., Smith, N. J. Rapid Knockout and Reporter Mouse Line Generation and Breeding Colony Establishment Using EUCOMM Conditional-Ready Embryonic Stem Cells: A Case Study. Front Endocrinol (Lausanne). 30, 105 (2015).
- Nagy, A., Rossant, J., Nagy, R., Abramow-Newerly, W., Roder, J. C. Derivation of completely cell culture-derived mice from early-passage embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (18), 8424-8428 (1993).
- Eggan, K., et al. Male and female mice derived from the same embryonic stem cell clone by tetraploid embryo complementation. Nat Biotechnol. 20 (5), 455-459 (2002).
- Eggan, K., et al. Hybrid vigor, fetal overgrowth, and viability of mice derived by nuclear cloning and tetraploid embryo complementation. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (11), 6209-6214 (2001).
- Eakin, G. S., Hadjantonakis, A. K., Papaioannou, V. E., Behringer, R. R. Developmental potential and behavior of tetraploid cells in the mouse embryo. Dev Biol. 288 (1), 150-159 (2005).
- Huang, J., et al. Efficient production of mice from embryonic stem cells injected into four- or eight-cell embryos by piezo micromanipulation. Stem Cells. 26 (7), 1883-1890 (2008).
- Poueymirou, W. T., et al. F0 generation mice fully derived from gene-targeted embryonic stem cells allowing immediate phenotypic analyses. Nat Biotechnol. 25 (1), 91-99 (2007).
- Behringer, R., Gertsenstein, M., Nagy, K. V., Nagy, A. . Manipulating the Mouse embryo. , (2014).
- Pease, S., Saunders, T. L. . Advanced Protocols for Animal Transgenesis. , (2011).
- Young, M. K., et al. Effects of mechanical stimulation on the reprogramming of somatic cells into human-induced pluripotent stem cells. Stem Cell Res Ther. 8 (1), 139 (2017).
